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研究背景肺癌是世界范围内发病率与死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌约占85%。目前肺癌的治疗模式是以手术为主的多学科综合治疗，但经几十年努力，其5年生存率未见明显提高。非小细胞肺癌患者最主要的死亡原因是术后转移和复发。国内外众多临床研究证实，循环肿瘤细胞是导致非小细胞肺癌术后转移与复发的重要因素，并且是评估预后的重要指标，因此检测非小细胞肺癌患者外周血、术中肺静脉血中的循环肿瘤细胞具有重要的临床意义。目前大部分相关研究在细胞水平检测外周静脉血中存在的循环肿瘤细胞，然而这些方法由于其自身灵敏度的限制，往往在转移性肿瘤患者血液中才能进行准确的诊断和分析。随着分子生物学及细胞生物学的迅速进步，FQ-PCR的普遍运用，使得高敏感度的循环肿瘤细胞检测成为可能。近年来，运用FQ-PCR及其各种改进方法检测循环肿瘤细胞的方法在乳腺癌、结肠癌的研究中均有运用，这些方法的敏感度普遍高于细胞水平检测方法。虽然此类方法缺乏细胞形态的证据，其特异性受到质疑，但可通过有效的手段弥补其不足。Taqman probe FQ-PCR在基因表达检测方面具有极高的灵敏度和特异度。本课题应用此技术，通过检测外周血及术中肺静脉血中细胞内EpCAM mRNA表达水平建立了定量检测非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的方法，并以体外循环肿瘤细胞模型验证了该方法的灵敏度和特异度，并且运用该技术检测非小细胞肺癌手术患者外周血和术中肺静脉血循环肿瘤细胞，探讨非小细胞肺癌循环肿瘤细胞数量与患者临床特征以及病理因素的关系及其临床意义。研究方法第一部分：分别以A549、NCI-H1975、NCI-H1299非小细胞肺癌细胞系建立非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的体外模型，并以EpCAM为检测的目的基因，使用Taqmanprobe QPCR方法检测体外模型中的循环肿瘤细胞，并验证本方法的特异度和灵敏度。第二部分：使用第一部分所建立的检测方法检测非小细胞肺癌手术患者外周静脉血和术中肺静脉血中的循环肿瘤细胞，并对部分患者的非小细胞肺癌组织进行免疫组化染色，检测非小细胞肺癌组织中的CD34表达情况，统计并分析原发实体瘤内微血管内肿瘤细胞计数与微血管直径比，同时分析循环肿瘤细胞水平与患者临床病理因素间的关系。并用部分良性肺疾病和健康志愿者进行对比研究。研究结果1.本研究成功建立了Taqman probe QPCR技术检测非小细胞肺癌循环肿瘤细胞方法，以循环肿瘤细胞所表达的EpCAM mRNA为检测靶标，使用Taqman probe QPCR检测体外模型中的非小细胞肺癌循环肿瘤细胞，其灵敏度为5tumor cells/107cells。2. Taqman probe FQ-PCR法检测220例非小细胞肺癌患者术前外周血中的循环肿瘤细胞，215例阳性，总阳性率为97.73％；术后外周血中的循环肿瘤细胞，188例阳性，总阳性率为82.45％；术中肺静脉血中循环肿瘤细胞，201例阳性，总阳性率为91.36％；3.非小细胞肺癌患者术前、术后外周血循环肿瘤细胞的检出与TNM分期、肿瘤细胞区域淋巴结转移情况、病理类型明显相关；4.非小细胞肺癌患者术前术后外周血循环肿瘤细胞存在显著差异；5.将220例非小细胞肺癌患者术前外周血循环肿瘤细胞检测结果与作为对照的40例良性肺疾病患者外周血循环肿瘤细胞检测结果进行对照比较分析，当作为肺部阴影良恶性鉴别时本方法的敏感性为100.00%，特异性为88.89%；6.非小细胞肺癌手术患者术前外周血循环肿瘤细胞的检测结果与术后手术病理组织石蜡切片微血管内肿瘤细胞浸润的比较，结果显示微血管内肿瘤细胞计数与微血管直径比（CV）对患者术前外周血循环肿瘤细胞数量的回归效果显著，即肿瘤内微血管内肿瘤细胞浸润与患者外周血循环肿瘤细胞数量间存在直接关系；研究结论1.建立了以Taqman probe FQ-PCR技术定量检测非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的方法，该方法的灵敏度、特异度均较高；2. CTCs的定量检测方法可用于肺部阴影良恶性的鉴别诊断，其敏感性为97.73%，特异性为100%；3.非小细胞肺癌患者手术前后循环肿瘤细胞的动态监测，证实术后患者CTCs数量较术前相比显著下降，提示该技术可用于非小细胞肺癌术后患者复发或转移的早期诊断。