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研究目的人类自身免疫性葡萄膜炎是一类严重的炎症性致盲眼病,近年研究认为辅助性T淋巴细胞17(Th17)与自身免疫性疾病的发生发展密切相关,在一些自身免疫性疾病的发展过程中Toll样受体7(TLR7)可以影响Th17细胞的分化,但TLR7在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)中是否可以通过树突状细胞(DCs)调控Th17细胞的作用机制还未见报道。CL097是一种能够活化TLR7的激动剂,本研究主要探究TLR7激动剂CL097处理的小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)对EAU中光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)1-20-特异性Th17细胞的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法首先通过体外重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)及重组小鼠白细胞介素(rm IL)-4(rm IL-4)定向诱导BMDCs,并应用流式细胞仪鉴定BMDCs。第6天向BMDCs中加入5μg/ml CL097作用8h,对照组加入等体积PBS,采用实时荧光(RT)-PCR技术检测CL097处理组与对照组BMDCs中IL-6,IL-23,IL-1β以及转化生长因子(TGF)-β(TGF-β)m RNA的相对表达量。将IRBP 1-20多肽片段与等体积含有结核杆菌素H37RA的弗氏完全佐剂(CFA)混合并充分乳化后主动免疫C57BL/6小鼠,利用间接检眼镜观察小鼠眼底炎症表现,并参照Caspi评分标准进行炎症评分。免疫后第13天取C57BL/6小鼠的眼球制作病理切片,并用苏木精-伊红染色后进行组织病理学检查。同时分离得到C57BL/6小鼠脾脏及淋巴结中IRBP1-20-特异性T细胞,并与CL097处理组及对照组BMDCs共培养至第5天,收集细胞。采用RT-PCR技术检测IL-17,γ干扰素(IFN-γ),维甲酸受体相关孤儿受体(ROR)γt(RORγt)和T盒21转录因子(T-bet)m RNA的相对表达量以及采用流式细胞仪检测Th1及Th17细胞的比率变化。将培养至第6天得到的高纯度BMDCs随机分为6组,并用CL097分别处理0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h,之后利用western blot检测各组BMDCs中p-p38,p-ERK1/2,p-JNK的蛋白表达量。结果1、定向诱导BMDCs的第6天,流式细胞仪鉴定结果显示BMDCs纯度可达90%。2、RT-PCR检测结果显示,BMDCs经CL097处理后IL-6、IL-23、IL-1βm RNA相对表达量较对照组显著升高(t=4.560,P=0.045;t=5.476,P=0.032;t=17.24,P=0.003),差异均有统计学意义,TGF-βm RNA相对表达量较对照组显著降低(t=10.41,P=0.009),差异有统计学意义。3、主动免疫后第13天成功建立小鼠EAU模型。4、流式细胞仪检测证实CL097处理组BMDCs与IRBP1-20-特异性T细胞共培养后第5天,与对照组相比,Th17细胞比例由(10.240±3.173)%升至(17.750±4.793)%(t=4.938,P=0.039),差异有统计学意义(t=4.938,P=0.039)。但Th1细胞比例为(1.123±0.356)%,较对照组(1.060±0.384)%基本无变化,差异无统计学意义(t=2.714,P=0.113)。5、RT-PCR检测结果显示,CL097处理组BMDCs与IRBP1-20-特异性T细胞共培养后第5天,与对照组相比,RORγt和IL-17 m RNA的相对表达量明显升高(t=8.844,P=0.013;t=8.831,P=0.013),差异均有统计学意义,而T-bet,IFN-γm RNA相对表达量基本变化不大(t=2.078,P=0.173;t=1.082,P=0.393),差异均无统计学意义。6、western blot结果显示经CL097刺激后,BMDCs中p-p38的蛋白表达量仅在0.25h较对照组0h显著升高,之后恢复至0h水平;p-ERK1/2在0.25h、0.5h表达显著升高后又恢复至0h水平;p-JNK在0.25h、0.5h、1h表达显著升高后又恢复至0h水平。结论1、在体外,TLR7激动剂CL097能够影响BMDCs分泌与Th17细胞极化相关的细胞因子,并间接促进EAU中Th17细胞的分化。2、TLR7激动剂CL097可能是通过活化BMDCs中MAPKs(p38、ERK1/2和JNK)信号通路来间接促进EAU中Th17细胞的分化。