肠道内栖息着细菌、真菌、病毒等种类繁多且数量庞大的微生物,共同构成了肠道微生物组。宏基因组分析显示噬菌体是最主要的肠道病毒,它们或整合于细菌基因组或以游离状态存在,对塑造菌群多样性及维持菌群结构、功能具有重要作用。乳杆菌(Lactobacilli)是肠道正常菌群,在其基因组中常整合有1-6个原噬菌体,深入分析这些噬菌体的生物学和遗传学特性,对于揭示肠道噬菌体多样性及对肠道环境的适应性具有重要意义。本论文围绕肠道常见乳杆菌原噬菌体及其基因组特征展开研究,首先对分离自肠道的乳酸菌进行诱导使其释放噬菌体,然后分析所释放噬菌体的生物特征及遗传组成;利用比较基因组学,分析肠道乳杆菌噬菌体与工业乳杆菌噬菌体的基因组差异,以揭示肠道生境塑造的噬菌体多样性及其适应性进化关系;最后挖掘原噬菌体编码的功能基因并研究其潜在应用。具体研究内容及实验结果如下:1.肠道乳杆菌原噬菌体的诱导释放及生物特性研究乳杆菌是重要的工业发酵剂菌株,也是肠道的正常菌群。许多工业乳杆菌携带有原噬菌体,在工业发酵过程中可脱离宿主而释放,导致菌株产酸能力降低甚至发酵失败。而对于肠道乳杆菌原噬菌体在肠道中的诱导特性还不清楚。本研究从不同人群的粪便样品中分离鉴定出17株乳酸菌,经丝裂霉素C处理后,其中的加氏乳杆菌W1、德氏乳杆菌G2、植物乳杆菌H1和唾液乳杆菌6-1分别释放出噬菌体颗粒。对噬菌体颗粒进行分离纯化、基因组酶切和外壳蛋白图谱分析,发现这4株菌的噬菌体的基因组成和蛋白外壳大小均存在差异且与已报道的乳杆菌噬菌体不同,初步鉴定这4株噬菌体为4种新的噬菌体。进一步模拟肠道内可能存在的胁迫条件,利用不同浓度的过氧化氢、胆盐、乳酸和乙醇诱导这4株溶原性乳杆菌以检验肠道环境对4种原噬菌体的诱导释放能力。结果发现,在各个浓度梯度的胁迫条件下,4株肠道乳杆菌均无明显裂解现象,即未获得游离的噬菌体颗粒,说明正常生理条件下,原噬菌体在宿主基因组上具有相对的稳定性,这一特性与工业乳杆菌噬菌体不同。2.肠道乳杆菌原噬菌体的基因组分析肠道噬菌体研究起步较晚,其基因组和相关生物信息学分析报道较少。我们对肠道来源的植物乳杆菌H1和唾液乳杆菌6-1释放的2种噬菌体及分离自肠道的德氏乳杆菌G2和干酪乳杆菌15-1全基因组测序,除了获得噬菌体phiH1、phi6-1全基因组序列信息外,还从测序的2株乳杆菌基因组上鉴别出3种完整的原噬菌体,分别为噬菌体phiG2、phi15-1和phi15-2。生物信息学分析显示,5种噬菌体基因组均为线性双链DNA,大小在32 kb至43 kb之间,GC%在32.64%至45.59%,基因组呈现功能模块化。噬菌体phiH1与植物乳杆菌ZJ316、JDM1、UNQLp11携带的原噬菌体的相似性整体超过73%,部分区域高达96.8%,说明其基因组差异性大多来源于与其他植物乳杆菌原噬菌体之间频繁的基因水平转移。其DNA复制模块存在独特基因,预示着该噬菌体对肠道环境具有适应性进化;噬菌体phi6-1与同类噬菌体的相似性低于48%,功能模块排布方式也存在差异,基因共线性强,水平转移较少;噬菌体phiG2的GC含量高达45.59%,与其同类噬菌体相似性低于9%,不存在大的连锁区,处于快速进化的阶段,推测是新产生的一种噬菌体;噬菌体phi15-1与干酪乳杆菌ATCC393中原噬菌体基因组有73%的相似性,二者结构模块有较高同源性,由同一噬菌体进化而来,其余部分同源性较低,经历突变和小范围的基因重组,发生适应性进化;噬菌体phi15-2与干酪乳杆菌W56、副干酪乳杆菌LOCK 919基因组携带的噬菌体同源性高,结构模块保守,推测可能来自于噬菌体介导的基因水平转移,其DNA复制模块与其他原噬菌体存在较大差异,赋予phi15-1特殊的复制特性。以上分析表明,肠道乳杆菌噬菌体具有明显的菌株特异性,但它们之间又具有一定的同源性,预示着噬菌体介导的基因水平转移频繁发生,同时在转导过程中伴随着基因的突变、插入和缺失,以致呈现出噬菌体的遗传多样性。3.肠道和工业乳杆菌噬菌体的基因组多样性及进化关系分析与简单、封闭的工业发酵环境相比,肠道噬菌体栖息的环境更为复杂、开放,由此促进其快速演变以适应环境。我们经测序和NCBI数据库检索共获得98种工业和肠道来源乳杆菌的原噬菌体基因组(其中59株基因组完整,39株不完整)。根据噬菌体保守的末端酶大亚基序列,构建系统发育进化树并进行核苷酸一致性(ANI)分析,结果显示所有98种原噬菌体起源自共同祖先,多数相同宿主的噬菌体属于同一类群,根据生境不同划分出密切相关的亚类群。基因水平转移、RecT介导的同源重组、点突变事件在肠道原噬菌体中普遍存在,并且获得了特殊功能基因如毒力基因、抗氧化基因和免疫基因等,以提高宿主菌在肠道环境中的存活率;不同于肠道原噬菌体,工业乳杆菌原噬菌体中基因水平转移及基因退化现象显著,更有利于提高乳杆菌在工业发酵中的生产性能。与工业原噬菌体相比,肠道原噬菌体的功能基因如穿孔素和裂解素基因更加多样,突变频率高。对两种来源乳杆菌CRISPR-Cas系统的比较分析发现,肠道乳杆菌的spacer能匹配到更多样的噬菌体类型,包括一些肠道病原菌噬菌体;而工业乳杆菌的spacer匹配的噬菌体类型较少,主要为工业乳品发酵过程中常见乳酸菌噬菌体和杂菌噬菌体。以上结果说明在肠道环境的压力下,乳杆菌原噬菌体呈现更高的多样性和功能可变性,为自身及宿主菌适应肠道生境提供遗传基础。4.原噬菌体穿孔素基因的潜在应用穿孔素是噬菌体编码的功能蛋白,能在细胞膜上形成非特异性孔洞,允许细胞内的蛋白通过细胞膜孔洞转运至胞外。我们选择5种乳杆菌噬菌体的穿孔素基因,分别在大肠杆菌中克隆表达,并以分子量大小不同的β-半乳糖苷酶(114kDa)、核酸酶B(NucB,20 kDa)作为报告蛋白,检测穿孔素形成的膜孔洞对不同蛋白的转运效率。实验结果表明,穿孔素HH1、H6-1和HG2均能成功地在大肠杆菌中表达,且在表达HH1和H6-1的重组菌株的细胞外检测到两种报告蛋白,预示HH1和H6-1允许至少20-114 kDa的蛋白穿过细胞膜,而HG2仅能允许20kDa左右的蛋白穿过。以上结果表明不同穿孔素形成细胞膜孔洞大小不同,为构建外源蛋白的转运系统奠定了基础。