MBL2基因与奶牛乳腺炎抗性研究

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本研究以中国荷斯坦奶牛为研究素材,运用real time-RT-PCR、基因定点突变、缺失启动子活性分析、基因克隆表达、PCR-SSCP等技术,测定MBL2mRNA在奶牛不同组织、不同基因型个体中的表达;对牛MBL25′调控区分析,对启动子功能鉴定和核心启动子进行研究;体外表达牛MBL-C蛋白,研究其野生型与突变型的抗菌机制及抗菌能力差异;MBL遗传多态性,确定其基因型、单倍型;在此基础上,统计分析MBL突变与高产奶牛生产性能测定数据,血清补体溶血活性的相关性,结果如下:中国荷斯坦牛MBL2基因外显子上存在单核苷酸多态性(g.1164G>A,g.1197C>A,g.1198G>A,1207T>C)与奶牛生产性状、奶牛血清补体活性和血清MBL-C蛋白含量相关分析表明,g.1164G>A,g.1197C>A位点的突变与体细胞评分有显著相关(P<0.01),与血清补体活性没有明显相关,g.1164G>A位点与血清MBL-C蛋白含量显著相关。实验成功突变了MBL2g.1164G>A位点,并体外表达了牛MBL-C野生型和突变型重组蛋白,证明重组蛋白对金黄色葡萄球菌有抑菌效果;扫描电镜观察发现野生型的抗菌能力要强于突变型。克隆了牛MBL25’调控区2285bp的DNA序列,用EGFP报告基因瞬时转染技术鉴定了该区域具有启动子功能。通过双荧光素酶报告基因检测系统筛选到牛MBL2基础启动子和调控组件,发现牛MBL2基因5′调控区的-85~+52bp区域具有基本的启动子功能,结合序列分析发现牛MBL2基因上存在多个正调控和负调控组件。通过对牛MBL2基因5’调控区的SNPs分析,首次发现了3个SNPs位点:g.905C>G,g.956C>T,g.895A>T,分析发现这三个位点位于HNF-1、C-Myb、TATA box转录组件,可能具有重要的功能。通过荧光定量RT-PCR方法表明牛MBL2mRNA在肝脏、甲状腺、心脏、脾脏、乳腺、肺脏、肾脏组织均有表达,在肝脏组织中表达量最高;对应g.905C>G和g.956C>T位点不同基因型间乳腺组织mRNA表达没有明显差异。可以初步推断MBL2基因可能是影响奶牛乳腺炎抗性的主效基因或是与乳腺炎抗性相关的QTL连锁基因。
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