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目的原发性肝癌(HCC)是全球六大恶性肿瘤之一,在男性常见恶性肿瘤中位居第三,在女性中位居第八。肝癌具有多血管、恶性程度高、生长速度快、转移范围广和复发率高等特点,临床治疗效果不理想,术后常需进行辅助性化疗,但由于肝癌化疗常产生多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象,严重阻碍了化疗的效果。在已知与MDR相关的蛋白中,已经确定SUMOylation是c-Jun、P53及HIF-1等蛋白翻译后重要的修饰形式,影响其生理生化功能。SUMOylation在肝癌MDR的形成中可能起着特定的作用。在肝癌产生MDR过程中,某些蛋白的SUMOylation状态可能发生改变,进而生理功能发生变化,使其对化疗药物抵抗性增加。本实验初步研究SUMOylation在肝癌耐药中发挥的作用及发生SUMOylation的途径。方法1.通过免疫组化方法检测癌组织与癌旁组织中小类泛素化修饰肽SUMO-1的表达。2.利用五氟尿嘧啶(5-FU)进行诱导建立5-FU耐药细胞系。通过比较肝癌细胞与5-FU耐药细胞系细胞的形态,增殖能力,以及对其他化疗药物的敏感程度,最终证明我们是否得到了稳定的肝癌多药耐药(MDR)细胞模型HepG2/R。3.通过Western Blot方法进一步比较人肝癌细胞与人肝癌多药耐药细胞模型中SUMO-1蛋白以及SUMOylation过程中各种酶的变化,来确定肝癌耐药是否与SUMOylation有关及这种现象又是通过何种途径产生。结果1.免疫组化试验结果显示,20例癌组织样本的胞质与胞核内SUMO-1均高表达,而癌旁组织不表达或低表达。2.历经1年时间利用5-FU诱导成功建立了肝癌多药耐药细胞模型(HepG2/R)。 HepG2/R与HepG2形态上存在差异,Hep G2/R有伪足伸出。两种细胞在细胞增殖能力上没有明显差异。当浓度在0.8-6.4μg/ml范围内的5-FU作用于两种细胞时,其对HepG2/R的抑制作用明显低于HepG2。此外,HepG2/R对紫杉醇和奥沙利铂产生了交叉耐药。3.不同浓度的5-FU作用于HepG2和HepG2/R细胞,两种细胞SUMO蛋白的表达有明显差异。在60kDa和11kDa的位置HepG2/R细胞表达特异性结合的SUMO蛋白和游离SUMO蛋白,同时,在30kDa的位置SUMO特异性结合蛋白表达明显增加。4.进一步比较参与SUMO化修饰过程的酶类的变化。两种细胞Aos-1的表达没有明显差异,Uba-2在HepG2/R细胞内存在与5-FU剂量相关的变化。Senp-1在HepG2/R细胞内明显升高,并且有计量相关性。结论1.本实验利用五氟尿嘧啶诱导肝癌细胞Hep G2,经历一年时间,建立了肝癌细胞多药耐药细胞模型Hep G2/R,通过药物敏感性试验,发现Hep G2/R细胞对五氟尿嘧啶明显耐药,此夕Hep G2/R还对紫杉醇和奥沙利铂产生了交叉耐药现象。在倒置显微镜下观察肝癌耐药细胞在形态上也发生了变化。通过描绘Hep G2细胞和Hep G2/R细胞的生长曲线,发现两种细胞的增值能力没有差异。2.我们的研究发现肝癌的多药耐药与SUMOylation状态的改变有关,这种改变主要与Uba-2和Senp-1的改变相关。因此,阻止SUMOylation状态的改变可能成为预防肝癌耐药的有效措施。