目的:　　葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，又称Bip或HSPA5，属于HSP70家族成员,其结构高度保守，功能多样，可作为内质网中的分子伴侣参与蛋白质的折叠和组装。GRP78亦可作为应激蛋白在缺氧、营养剥夺、病原微生物感染和理化刺激等时表达升高从而保护细胞免受应激诱导的凋亡。近年来研究发现GRP78也可以分泌型蛋白的形式释放到细胞外微环境中，发挥免疫调节作用，并有学者将其归类为炎症消退相关分子（resolution-associated molecular pattern,RAMP）。本课题组前期研究发现，过表达GRP78不但可以保护胰岛细胞抵抗免疫损伤引发的凋亡，还可诱导免疫负性调节分子的表达。进一步研究发现GRP78在体外可诱导低表达CD40、CD86及高分泌IL-10的耐受性DC，并可下调脂多糖（LPS）诱导的CD86、CD40以及TNF-α的表达；还可诱导PD-L1和FasL均高表达的调节性B细胞的产生，但其作用机制尚不清楚。本研究拟在前期基础上，体外研究了GRP78在LPS诱导的炎症中的作用以及GRP78—DCs间相互作用模式，探寻了与GRP78相互作用的细胞膜分子和相关信号通路，为进一步研究其在诱导免疫耐受以及肿瘤免疫逃逸中的作用提供科学的理论基础与实验数据。　　方法:　　1.小鼠GRP78的表达与纯化　　将小鼠GRP78原核表达载体（pGEX-4T3-GRP78）转化大肠杆菌BL-21，IPTG诱导蛋白大量表达，裂解细菌离心收集带GST标签的可溶性GRP78蛋白，应用GST纯化柱纯化蛋白，凝血酶切除GST标签后收集蛋白，反复通过内毒素结合柱子，最后收集的蛋白通过无菌超滤管浓缩，鲎试剂检测内毒素含量低于10EU/ml，BCA试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE和western blot鉴定后-80℃保存备用。　　2.小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)诱导和培养　　取6～8周龄WT C57BL/6以及C57BL/6背景的TLR4KO、CD14KO雌鼠股骨和胫骨中骨髓来源的单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells，BMMCs），裂解红细胞，加入完全培养基（RPMI1640+10％胎牛血清）、细胞因子GM-CSF（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）以及青霉素/链霉素（100U/ml），置于5%CO2、37℃温箱中培养6-8天，流式细胞术分析CD11c阳性比例>90%。　　3.不同组处理野生型（WT）小鼠BMDCs后上清细胞因子及细胞mRNA的检测　　阴性对照组、LPS组、不同浓度的GRP78+LPS组处理WT小鼠BMDCs，2小时后提取细胞总RNA，qPCR检测细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β的mRNA表达水平；同时设置4小时处理组，ELISA检测上清中IL-6、TNF-α和IFN-β表达水平。　　4.GRP78处理后DCs中TLR4的表达及定位分析　　不同浓度GRP78于37℃处理WT小鼠BMDCs和DC2.4细胞系30min，流式细胞术分析DCs表面TLR4表达水平；激光共聚焦显微镜检测TLR4在细胞膜/内的表达以及与细胞内早期溶酶体标志物LAMP1的共定位情况；western blot检测蛋白翻译抑制剂Puromycin和溶酶体抑制剂Chloroquine存在时GRP78对TLR4表达水平的影响。　　结果:　　1.GRP78对LPS诱导炎症细胞因子表达的影响　　ELISA检测显示，与阴性对照组相比，LPS可诱导BMDCs分泌高水平的TNF-α、IL-6和IFN-β，而GRP78则可抑制上述促炎细胞因子的产生，并且随着GRP78浓度的升高其抑制效果越明显；仅仅在1μg/ml浓度的GRP78存在时就可以显著抑制LPS诱导的IFN-β的产生，而在40μg/ml浓度的GRP78存在时，LPS诱导的上述炎症因子几乎被完全抑制。qPCR检测细胞炎症因子的mRNA水平与上述结果一致。说明GRP78可抑制LPS诱发炎症因子的产生。　　2.GRP78对TLR4表达和定位的影响　　(1)ELISA检测证明LPS几乎不能诱导TLR4缺陷小鼠BMDCs分泌TNF-α，流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测结果表明GRP78在37℃处理30min时可明显下调DC2.4细胞膜TLR4的表达，且随着GRP78浓度的升高TLR4下调的效果越明显。在40μg/ml浓度的GRP78处理30min时细胞表面TLR4平均荧光强度（MFI）降低近75%。说明TLR4作为LPS发挥促炎作用的关键受体，GRP78可能通过下调其在DCs表面的表达发挥抗炎作用。　　(2)激光共聚焦显微镜结果表明GRP78处理DC2.4后TLR4发生了明显的内吞，并且与早期溶酶体标志物LAMP1有荧光共定位现象；Western blot检测发现在GRP78和蛋白翻译抑制剂Promycin共同作用时BMDCs中TLR4蛋白水平随着时间的增加而减少，而与溶酶体抑制剂Chloroquine共同作用时BMDCs中TLR4蛋白水平随着时间的增加而增加。说明GRP78通过诱导TLR4的内吞下调TLR4在细胞膜上的表达，并且内吞的TLR4进入溶酶体被降解。　　3.GRP78与DCs之间相互作用模式　　流式细胞术检测结果表明AF488-GRP78可以与BMDCs和DC2.4细胞结合，激光共聚焦显微镜检测在4℃（阻止细胞小泡转运）时90%～95%的细胞膜表面可结合AF488-GRP78从而显示出明显的绿色荧光，而AF488-BSA对照组细胞膜未见绿色荧光。37℃时GRP78仍显示绑定于细胞膜表面而未发生内吞。说明GRP78是通过蛋白与DCs细胞膜相互作用的模式发挥作用。　　4.GRP78与DCs细胞膜分子之间相互作用模式　　(1)激光共聚焦显微镜检测结果表明AF488-GRP78在DC2.4细胞膜上发出的绿色荧光与标记TLR4的红色荧光不存在共定位现象，并且通过GST-pull down实验也未检测到TLR4与GRP78有结合。说明GRP78不通过与TLR4直接相互作用下调TLR4表达。　　(2)激光共聚焦显微镜检测结果表明AF488-GRP78在DC2.4细胞膜上发出的绿色荧光与标记CD14的红色荧光存在高度重合的共定位现象；并且AF488-GRP78可与转染CD14的293T细胞膜结合并有共定位现象，而不与转染空载的293T细胞结合；通过GST-pull down实验和IP实验证明GRP78与CD14有直接结合，说明GRP78可能通过与CD14相互作用下调TLR4表达。　　5.GRP78截短片段的构建及其与CD14相互作用　　GST-pull down实验证明截短的GRP78蛋白19-392/393-655/281-655aa（其中19-280aa片段质粒在BL21中无可溶性蛋白表达）均不能与CD14结合，说明只有全长GRP78蛋白与CD14有相互作用。　　6.GRP78与CD14相互作用对DC功能影响　　(1)流式细胞术检测结果表明AF488-GRP78可与WT小鼠BMDCs结合而不与CD14KO小鼠BMDCs结合，进一步说明GRP78可通过与CD14相互作用调控DCs的功能。　　(2)通过流式细胞术检测发现GRP78在37℃处理WT-BMDCs细胞30min时可明显下调细胞膜表面TLR4的表达，并且随着GRP78浓度的升高TLR4下调的效果越明显；而不同浓度的GRP78均不能有效下调CD14KO-BMDCs膜表面TLR4的表达。Western blot检测提示GRP78不能诱导CD14KO-BMDCs中TLR4进入溶酶体被降解，ELISA检测显示在CD14KO-BMDCs中GRP78也不能抑制LPS诱发TNF-α的表达。说明GRP78通过CD14依赖的方式抑制LPS诱导的炎症因子分泌。　　(3)为了证明GRP78诱导的TLR4内吞是否激活TRIF-IRF3-IFNα/β信号通路，western blot检测了对照组、GRP78组、LPS组和GRP78+LPS组处理WT和CD14KO小鼠BMDCs时IRF3的磷酸化情况，发现GRP78组不能活化WT-BMDCs中IRF3，而且还可抑制LPS诱导的IRF3的磷酸化；而CD14KO-BMDCs中各组处理后均不能活化IRF3。说明BMDCs中IRF3的活化是CD14依赖的，而GRP78诱导的是一种非炎症性的TLR4内吞效应。　　结论:　　本课题探讨了GRP78在LPS诱导的炎症因子分泌中的作用，以及对GRP78和DC相互作用模式及相关分子间的相互作用机制进行了研究，研究结果表明：①GRP78具有抑制LPS诱导DCs表达TNF-α、IL-6、IFN-β等炎症细胞因子的功能；②GRP78可下调DCs膜表面TLR4表达，而TLR4在LPS诱导的炎症中发挥重要作用。③GRP78通过与DCs膜表面CD14相互作用诱导膜上TLR4内吞后进入溶酶体降解，从而下调TLR4在DCs膜表面的表达；④GRP78通过CD14依赖的方式诱导一种非炎症性的TLR4的内吞，从而抑制了TLR4激动剂LPS诱发的炎症反应；⑤CD14作为TLR4的共受体，在TLR4介导的炎症过程中发挥双重作用：即LPS诱导的促炎作用和GRP78诱导的抑炎作用。