膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，据统计大约75％的病例为浅表性膀胱癌，其中95％为高危浅表性肿瘤。高危浅表性肿瘤术后若不给予任何药物治疗，其近期复发率为60～90％。如何预防膀胱肿瘤术后复发、治疗术后残余瘤与原位癌是临床亟待解决的重大问题。BCG是一种由毒力极强的牛型分枝杆菌形成的生物免疫调节剂，全世界广泛用于预防结核病，至今已半个多世纪，证明有高度的安全性和极少的严重并发症。膀胱腔内灌注BCG在预防肿瘤复发、治疗残留肿瘤和原位癌等方面已经取得了令人满意的临床疗效，但仍有30％～45％的病人对腔内BCG灌注治疗无反应，长期随访的患者甚至可达50％。此外，腔内BCG灌注亦可引起膀胱局部和全身反应，5％患者可出现严重并发症，0.5％甚至可以危及生命，也使BCG腔内灌注用于预防和治疗浅表膀胱肿瘤受到一定的限制。 近年来，IFN作为二线药物也用于膀胱灌注，治疗膀胱肿瘤。虽然其40％的缓解率明显低于BCG，但对部分BCG无反应的患者，IFN却有一定效果。此外，IFN的局部和全身毒性较小。因此，也引起了人们的高度重视。然而，该方案费用较高且需要多次反复灌注，影响了其进一步广泛应用。 基于上述BCG和IFN在膀胱肿瘤治疗方面应用结果，人们为了进一步提高膀胱肿瘤免疫治疗的疗效，采用小剂量BCG和IFN-α联合灌注。结果显示，该方案具有较好的耐受性和较高的完全反应率。在鼠膀胱癌模型的实验中也显示，BCG和IFN-α联合应用的疗效均优于二者单独应用。BCG和IFN-α联合应用时，由于降低了BCG的用量，从而减轻了其毒性，同时，又保持或提高了BCG的抗肿瘤活性。虽然到目前为止，IFN-α提高BCG的抗肿瘤作用的确切机制尚未清楚，但近来的研究结果显示，IFN-α可在以下几方面提高BCG的免疫活性：(1)协同增加免疫细胞IFN-γ和IL-2的产生；(2)明显增加T细胞；(3)提高对膀胱肿瘤的直接作用，如抑制生长和诱导细胞因子(IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α)等。 天津医科大学博士学位论文 在人们研究利用BCG与包括干扰素在内的各种细胞因子联合应用来提高膀胧肿瘤的疗效和降低BCG的副作用同时，也着手构建具有分泌细胞因子的重组BCG菌苗，以达到既能通过降低BCG用量而减少其副作用，又能通过重组BCG的持续分泌细胞因子来克服直接使用细胞因子时所带来高额费用和反复灌注的缺点。有鉴于此，本课题通过构建在BCG中具有高效表达分泌功能的穿梭质粒，将其转导到BCG中，使重组BCG能够分泌性表达址FN心一ZB。该重组BCG与野生型BCG相比有以下创新之处:①由于重组BCG能够分泌细胞因子，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下可较野生型BCG降低用量，从而降低了毒副作用;②重组BCG能够分泌细胞因子避免了直接使用细胞因子所带来的高额费用和反复灌注的缺点;③重组BCG能够在最为合适的时间和部位分泌细胞因子。 提高BCG的疗效、减低其副作用和探讨其作用机制是目前BCG进一步发展和应用急需解决的问题。虽然目前人们对BCG的抗肿瘤作用机制有了一定的了解，普遍认为BCG诱导的抗肿瘤作用为细胞免疫反应，但是具体的作用机制尚未完全清楚。而且，BCG在体内的具体发挥作用的过程及BCG最后的命运也同样是值得关注的问题。因此，探讨BCG在体内的作用过程和作用机制也是进一步研究BCG的一个重要方面。鉴于上述目的，给于BCG加上标记显得尤为重要。人们也采取了荧光染色和电子显微镜等方法对BCG的作用过程进行了探讨，但是，上述方法需要对组织进行特殊处理或与BCG进行共同培养，方法较繁琐，易出现标记物丢失等问题，有时也会影响BCG的一些特性。如果能使BCG自己产生一种标记，将对BCG的作用过程具有重要价值。随着如上所述重组BCG基因工程技术的发展，能够产生标记蛋白的重组BCG的技术条件己日趋成熟。被称为“活细胞探针”的绿色荧光蛋白是一种无毒的标记蛋白，人们己经将其广泛应用于多种细胞基因克隆的标记物。本课题采用基因工程技术，将GFPcDNA利用穿梭质粒作为载体转导到BCG内，使其表达GFP蛋白，以用于对BCG的作用过程、机制以及其最后命运的探讨。表达GFP的重组BCG在探讨BCG的作用过程方面与电镜或荧光体标记等方法相比 一4一天津医科大学博士学位论文有以下优点:(a)不需要预处理而直接将绿色荧光体应用到目的宿主;(b)重组BCG表达的绿色荧光均匀一致，对宿主吞噬病原体进行定量分析时准确可靠:(c)GFP相当稳定，即使在很强的光线刺激下也不易褪色;(d)GFP的荧光在活细胞和固定后细胞中均可观察，尤其是适用于监测BCG在体内的作用过程;(e) GFP的光学特性与FITC相似，适用于标准荧光显微镜观察和流式细胞计定量分析。第一部分 户用响讨B穿梭质粒的构建、转导及其在BCG中的表达一phiFN一a一ZB穿梭质粒的构建 以含有BamHI酶切位点和hIFN一a一ZB第一到第八密码子的上游引物和含有EcoRJ酶切位点和终止密码子的下游引物作为一对引物，以含有hIFN一a-ZBcDNA