程序性细胞死亡(PCD)不仅存在于植物生长发育过程,并且参与植物对生物和非生物胁迫的应答。受到病原菌侵染后,植物会产生超敏反应,它是植物主动的程序性细胞死亡的过程。类病变突变体是一类在没有受到生物和非生物胁迫下,植物自身产生坏死病斑的突变材料。其产生坏死病斑的过程类似于植物的超敏反应。大多数类病变突变体都具有增强的病菌抗性。所以类病变突变体是研究植物PCD和抗病机制的重要工具。黄萎病是一种严重的真菌病害,具有寄主多样性。许多重要的粮食及经济作物都是黄萎病的寄主,其中包括番茄、马铃薯、棉花等。棉花是世界上重要的经济作物和纤维来源,其中陆地棉的种植面积最为广阔,占全球棉花种植面积的90%以上。然而由于陆地棉缺少免疫或高抗黄萎病抗源,培育高产优质抗黄萎病品种一直是困扰育种家的一个难题。我们首次在陆地棉品种中发现了一个类病变突变体,命名为Ghlmm。将棉花类病变突变体Ghlmm与陆地棉遗传标准系TM-1杂交,F1植株表型为野生型。F1植株自交得到F2群体共有763株,其中有209株表型为Ghlmm表型,554株为野生型。卡方值为2.202,符合孟德尔遗传定律3:1分离比,由此说明Ghlmm突变体表型是由隐性单基因控制的质量性状。通过本实验室构建的高密度遗传连锁图谱,我们将GhLMM基因定位到D5染色体上,在标记NAU7928和S2393之间,两个标记的物理距离为371kb。此区间内共有25个基因,其中只有12个基因在TM-1叶片转录组测序中FPKM值大于1。qPCR检测发现,与W0相比,只有Gh_D05G2237和Gh_D05G2254在突变体中表达量显著下降。我们在TM-1,W0和Ghlmm中分别克隆了Gh_D05G2237和Gh_D05G2254基因及其A亚组的同源基因。Gh_D05G2254基因在3个材料中序列并没有差异。Gh_D05G2237在Ghlmm的127bp处出现了单核苷酸突变。由GGA突变为TGA,形成了终止密码子,造成了基因的提前终止。在W0中分别沉默Gh_D05G2237和Gh_D05G2254,并观察沉默后表型。VIGS结果发现,沉默Gh_D05G2254后,W0仍然表现为野生型,叶片上并没有出现坏死斑。而沉默Gh_D05G2237后叶片出现了类似Ghlmmm突变体叶片局部坏死的表型。根据突变位点设计突变体位点具有扩增产物的SNP引物,发现F2群体中209株突变体表型植株全部具有扩增产物没有分离,而野生型表型的植株表现1:2的无带和有带的分离,说明Gh_D05G2237为突变基因。根据基因注释结果,Gh D05G2237编码ALAD蛋白(5-氨基乙酰丙酸脱水酶),其功能是将2分子的5氨基乙酰丙酸(ALA)转化为1分子的胆色素原(PBG)。这一过程是合成所有四吡咯化合物必须经历的。植物中四吡咯化合物主要有叶绿素、血红素、亚铁血红素等,参与植物的光合作用,呼吸作用,氮的同化过程。全基因扫描发现,TM-1中ALAD基因只有两条:位于D亚组的Gh_D05G2237,命名为GhLMMD;位于A亚组的Gh_A05G3720,命名为GhLMMA。GhLMMA和GhLMMD在棉花中具有组成型表达的模式,其A、D亚组基因的表达水平基本相同,且在叶片、纤维及胚珠发育早期表达量相对较高。GhLMM基因定位在叶绿体中,这与其参与植物四吡咯合成的功能是对应的。对来源于17个物种的23个ALAD基因进行进化分析发现,在调查的所有物种中,ALAD基因数量最多的只有2条,其结构上也十分相似。说明ALAD基因进化上非常保守,功能十分重要。在转录水平上检测W0和Ghlmm中GhLMMA和GhLMMD的基因表达,发现Ghlmm的根、茎、叶中,GhLMMD基因的表达极显著下降,而GhLMMA却没有显著性变化。在蛋白水平上,Ghlmm叶片中的ALAD酶活极显著下降。GhLmmA基因并没有补偿GhLMMD功能丧失,说明GhLMM基因具有剂量效应。生理数据表明Ghlmm突变体细胞死亡是由于GhLMM基因剂量不足导致ALA积累和ROS的爆发所引起的。室内黄萎病抗性鉴定发现Ghlmm具有显著增强的黄萎病抗性。为研究其抗病机理,我们用W0和Ghmmm叶片进行转录组测序。以q值<0.05,表达差异4倍为筛选标准,共发现2069个差异表达基因。其中1541个基因上调表达,528个基因下调表达。GO富集结果显示Ghlmm中与胁迫,防卫反应,植物免疫等相关基因被显著富集。qPCR结果显示,在Ghlmm突变体根、茎、叶中,PR1、2、3、4、5、6、10七种不同类型的PR基因都有显著的上调表达。PR基因的表达受SA信号调控。SA检测发现,在茎和叶片中,Ghlmm的SA的含量显著高于W0。表明SA的积累和组成型表达抗病基因赋予了 Ghlmm突变体显著增强的黄萎病抗性。突变体中ALA的积累引起ROS的爆发,ROS是如何激活SA信号通路导致PR基因的表达?针对此问题我们检测了Ghlmm突变体叶片中SA合成调控基因。我们发现SA上游合成调控基因GhEDS1和GhPAD4以及SA合成关键基因GhPAL都显著上调表达。并且它们受到过氧化氢诱导后都显著上调表达。另外SA可以抑制CAT酶活,突变体中SA的积累导致CAT的酶活受到了显著的抑制。AIP(2-氨基茚满-2-磷酸)可以通过抑制PAL的酶活抑制SA的合成。当突变体喷施AIP之后,W0和Ghlmm突变体叶片中SA含量也显著下降到相同水平,叶片细胞死亡的表型消失。突变体PR基因表达都显著下降到与WO相同水平。ROS染色发现,Ghmmm突变体ROS含量下降。在突变体中ROS和SA具有循环放大的效应,并且此效应是引起Ghlmm突变体PCD所必需的。为研究GhLMM基因的剂量效应在调控植物生长发育和抗病之间的关系,我们设计了 2个实验。其一、通过外施不同浓度LA(乙酰丙酸)来模拟GhLMM基因的抑制表达。我们发现,喷施0、1、5、10、20、30mM的LA 24小时后,喷施20mM和30mM的W0叶片表现出Ghlmm突变体表型,而10mM具有不明显的细胞死亡现象。0、1、5mM LA喷施后,棉花叶片不形成坏死斑。随着LA喷施的浓度的增加,ALA、过氧化氢、SA的含量也随着增加。并且PR基因的表达趋势也是随着LA浓度的增加,表达量升高。通过传统的遗传实验,配制W0和Ghlmm突变体杂种F1代,并检测其抗病性,及各项生理指标。结果发现F1植株抗病性及各项生理指标都处于三个材料中间水平。Ghlmm突变体分别与TM-1、军棉1号的杂种F1代黄萎病抗性鉴定得到了相同的结果。四个GhLMM基因拷贝的WT(AADD)生长正常,但是抗病信号通路没有激活;三个拷贝的(W0 × Ghlmm)F1(AADd)生长正常,抗病信号通路激活;两个拷贝的Ghlmm突变体(AAdd)发生PCD,抗病信号强烈激活。而VIGS将GhLMM沉默后,植株最终死亡。综合以上实验我们得出,GhLMM基因的剂量效应能够调节植物生长和抗病之间的能量分配,使植物以最小的生长代价达到最大的抗病效果。