骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是一种高度恶性的原发性骨骼肌肉系统肿瘤,发病率居骨原发肿瘤的第2位,发病高峰年龄15～25岁,高发部位为股骨远端、肱骨近端、胫骨干骺端,该病临床表现为肢体疼痛、肿块、病理性骨折等.部分患者伴有发热、贫血及体重下降等,并可发生远处转移,对青少年的健康造成严重的伤害,有较高的死亡率和致残率。1970年以前,截肢术是其标准治疗方案,随着新辅助化疗的广泛应用以及关节重建技术的发展,保肢治疗已成为骨肉瘤外科治疗的主流趋势,该理念的主要内容为在不增加骨肉瘤对患者危害的前提下,尽量保留患者的自身关节结构以利于患肢功能的恢复,克服因机械重建而导致的肢体短缩、假体松动等远期并发症,从而实现恶性骨肿瘤肢体骨缺损的生物学重建。但是值得强调的是骨肿瘤的保肢治疗首先需要达到安全的外科边界以降低局部复发率,安全外科边界是通过广泛切除原发性肿瘤,同时切除肿瘤周围部分正常组织,来实现治疗目标。然而目前尚无对广泛切除范围的定量标准,如何确定临近或显微镜下的阳性边缘仍存在争议。此外,尽管普遍认为通过辅助化疗就可以达到治疗远处微小病变的目的,但对局部残留病变的治疗仍然存在争议。另外,在骨肉瘤切除后,经常使用结构性同种异体骨移植来进行重建,但是宿主骨与移植骨不愈合成为越来越具有挑战性的问题。骨形态发生蛋白(BMP)能促进骨愈合,已经广泛应用于非肿瘤骨科手术中,但是由于已知骨肉瘤细胞有BMP受体的表达,因此,若手术后仍残留少量微小肿瘤组织,从理论上来说,外源性BMP会刺激它的生长,故临床上普遍不愿将其运用于骨肉瘤术后患者,但这只是基于临床前实验结果的推测,仍存在争议。到目前为止,尚无临床证据支持外源BMP的使用会促进骨肉瘤的生长。本实验通过建立人骨肉瘤Mg-63细胞株裸鼠模型,比较不同治疗方法来评价手术边界与局部复发的关系,将广泛切除范围进行定量分析,同时对BMP-2的运用和局部复发之间的相关性也进行了评价。在骨肉瘤患者接受化疗的过程中,部分患者可能出现多药耐药现象,严重影响了化疗的效果,常常导致化疗失败,影响预后。本实验通过建立人骨肉瘤耐药细胞株MG63/ADM动物模型,然后采用不同的化疗方案来评估手术边界与局部复发的关系。三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)是砒霜的主要成分,对造血系统、消化系统以及生殖系统等恶性肿瘤有较好的疗效,但在骨肉瘤中的研究还很少,本实验对三氧化二砷与阿霉素的协同作用也进行了评价。第一部分比较不同治疗方法评估手术边界与局部复发的关系目的：在骨肉瘤手术中,如何来定义一个合适的外科切缘,既能提高重建的效果和改善功能预后,又能控制局部复发,是一个日益受到关注的问题。通过建立人骨肉瘤细胞株MG-63动物模型,采取不同的治疗方法来评估手术边界与局部复发的关系,并对手术切缘进行定量分析。方法：1、建立人骨肉瘤细胞Mg-63原位异种移植裸鼠模型：人骨肉瘤细胞Mg-63用辅以100U/ml青霉素、10%胎牛血清、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基在37℃,C02体积分数5%的培养箱中常规培养传代。取对数生长期的Mg-63细胞,胰蛋白酶消化后用RPMI-1640培养基培养基制成细胞悬液,对细胞计数并将细胞浓度调整为2×107/ml,无菌条件下将25μl Mg-63细胞悬液注入裸鼠胫骨上段髓腔内。2、对裸鼠模型施与不同的治疗方法：将裸鼠模型随机分为4组,每组30只,分别是手术组、手术+单药(顺帕或阿霉素)化疗组、手术+双药(顺帕和阿霉素)化疗组。3、对不同的实验组之间分别进行评价：将手术+单药化疗组和手术+双药化疗组分别和手术组进行比较,来评价不同的治疗方法之间手术边界和局部复发的关系。结果：在原位异种移植小鼠模型中,骨肉瘤的生长与发展遵循一种有特征的自然进程,很好模拟了人骨肉瘤的生长过程。对于仅采取手术治疗的实验组,手术切除范围如果超过骨肉瘤病灶边界994μm以上,无一例发生局部复发。对于采取手术和单药化疗的实验组,手术切除范围如果超过骨肉瘤病灶边界37μm以上,无一例发生局部复发。手术组+单药化疗组和手术组的手术边界对比差异具有显著性(顺帕组,p<0.05,阿霉素组,p<0.05)。对于采取手术和双药化疗的实验组,手术切除范围如果超过骨肉瘤病灶边界11μm以上,无一例发生局部复发。手术组+双药化疗组和手术组的手术边界对比差异具有显著性(p<0.05)。结论：本模型可靠的模拟了人类骨肉瘤患者的临床过程、放射影像及手术方式,也成功的借鉴了人类骨肉瘤患者的化疗经验。与仅行手术治疗实验组对比,手术和单药化疗实验组达到局部控制的手术边界明显减小,而手术和双药化疗实验组显著减小。第二部分外源性BMP-2的运用与局部复发的相关性目的：BMP-2在大量的临床前实验中已证实能促进骨质愈合,在临床上也广泛的运用在一些非肿瘤的骨科手术中。骨肉瘤切除后,运用异体骨移植来进行重建的患者,骨不愈合仍然是具有挑战性的问题,但经典理论认为BMP-2能促进肿瘤复发而不建议使用。通过建立人骨肉瘤动物模型,评估外源性BMP-2的运用与局部复发的相关性。方法：建立人骨肉瘤细胞Mg-63原位异种移植裸鼠模型,然后将动物模型随机分为2组,每组30只,分别是手术+BMP-2组、手术+双药化疗+BMP-2组,然后分别将手术+BMP-2组和手术组,手术+双药化疗+BMP-2组和手术+双药化疗组进行比较。结果：对于手术+30μgBMP-2实验组,骨切缘大于687μm和软组织切缘大于640μm未出现局部复发,骨切缘小于91μm和软组织切缘小于80μm均出现了局部复发,与单纯手术组比较,未发现明显的组间差异(p>0.05)。对于手术+双药化疗+30μgBMP-2实验组,骨切缘小于9μm和软组织切缘小于8μm均导致局部复发,而骨切缘大于11μm和软组织切缘大于9μm,无一例出现局部复发,与手术+双药化疗组比较,未发现明显的组间差异(p>0.05)。结论：无论在单独手术治疗组还是接受手术联合化疗的治疗组中,肿瘤切除后在手术部位施用外源BMP-2并不增加局部复发的风险。第三部分建立人骨肉瘤耐药细胞株MG63/ADM动物模型评估手术边界与局部复发的关系目的：在对骨肉瘤患者进行化疗过程中,部分可能出现多药耐药现象,导致化疗失败。建立人骨肉瘤耐药性MG63/ADM模型,给予手术和不同的化疗方案,评估手术边界与局部复发的关系。方法：1、耐药细胞株MG63/ADM的建立。2、建立人骨肉瘤耐药性MG63/ADM细胞原位异种移植裸鼠模型。3、将动物模型随机分为4组,每组30只,分别是手术组、手术+阿霉素组、手术+三氧化二砷组、手术+阿霉素+三氧化二砷组。4、对不同的实验组进行比较。结果：对于手术组,大于936m的骨切缘和大于748μm的软组织切缘均导致了局部控制,对于手术+阿霉素治疗组,大于705μm的骨切缘和大于627μm的软组织切缘无一出现局部复发,与手术组相比较,组间不存在显著差异(p>0.05)。对于手术+三氧化二砷组,大于582μm的骨切缘和大于494μm的软组织切缘无一出现局部复发,与手术组相比较,结果表明无论软组织切缘还是骨切缘,不存在显著差异(p>0.05)。对于手术+阿霉素+三氧化二砷组,大于52μm的骨切缘和大于44μm的软组织切缘均导致了局部控制,与手术组局部复发的手术切缘相比较,结果表明无论软组织切缘还是骨切缘,组间存在显著差异(p<0.05)。结论：手术广泛切除和辅助化疗是治疗骨肉瘤的两个重要措施,对于产生多药耐药骨肉瘤,手术切除范围应适量扩大。三氧化二砷在逆转骨肉瘤多药耐药方面有一定的作用。