楸树优良无性系2-8苗期生理变化与基因表达对干旱胁迫的响应

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楸树(Catalpa bungei)是我国特有珍贵用材树种,分布范围广,材质优良,已有2600多年的栽培历史,目前主要作为高档家具和细木工板材等原材料。然而,目前推广的主栽品种抗旱性较差,在相对干旱的条件下表现不佳。因此,为了提高在相对干旱条件下楸树的生长量,开展种内耐旱和高水分利用效率新品种选育成为重要的研究方向。了解楸树对干旱胁迫的生理和分子响应机理,挖掘关键基因,是开展高效育种的基础。本研究以楸树优良耐旱无性系为试材,利用高通量测序技术建立转录本集合,通过干旱处理和基因芯片技术挖掘胁迫响应关键基因,并结合生理变化,对响应机理进行阐述。主要结果如下:(1)在自然干旱胁迫过程中,当土壤重量含水量下降到23%时,苗高、地径和叶片生长基本停止,成熟叶片的叶面积为正常条件下的53%(93.5cm2),净光合速率(Pn)和光合性能指数(PI)显著下降;当土壤含水量下降到15%时,Pn接近于0,叶片和根系游离脯氨酸、可溶性糖、脱落酸含量在胁迫下均显著升高,茉莉酸含量则轻微升高,可溶性蛋白含量先升高后降低,叶片和根系的SOD、POD活性、以及叶片POD活性均呈现为先下降,后期呈显著升高的趋势。(2)采集正常和干旱胁迫条件下3个楸树基因型的叶片、根、茎等组织进行混合转录组测序(454焦磷酸测序),共获得77,337个Unigene,在Nr数据库中比对,共有33,672个Unigene具有同源序列,其中有19,110个获得GO功能注释。通过KEGG代谢通路富集,共参与了包括碳水化合物、氨基酸、脂肪酸代谢(Carbohydrate,Amino acid,Fatty acidmetabolism)、光合作用(Photosynthesis)等在内的250个代谢通路。发掘了包括双碱基重复(Di-)至六碱基重复(Hexa-),以及混合型在内的2,782个SSR和79,528个SNP。(3)依据转录组测序结果,设计了表达谱芯片,并依据干旱胁迫下生长和生理变化趋势,选择了5个土壤含水量梯度对叶片和根系进行差异基因表达分析。与对照相比,4种胁迫下叶片中差异表达基因共有16,137个,根系中共有14,913个,叶片中有2,233个基因是在4种胁迫下共差异表达的,其中有630个随胁迫加重表达量呈不断升高或降低的趋势(持续差异基因)。根系中有1,006个基因是在4种胁迫下共差异表达的,其中有203个随胁迫加重表达量呈不断升高或降低的趋势(持续差异基因)。对叶片和根系中的持续差异基因进行GO和KOG注释表明,主要涉及到信号转导途径、转录、离子跨膜转运、渗透调节物质合成、抗氧化酶和激素合成等方面。(4)通过功能分析,发掘到与干旱胁迫响应相关的基因,主要包括4个方面:信号转导相关基因:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine/Threonine-protein kinase)、富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)类受体蛋白激酶、MYB、MYC、bZIP、NAC;抗氧化酶基因:原叶绿素酸酯氧化还原酶(NADPH: protochlorophyllideoxidoreductase)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)、环阿乔醇-C-24位甲基转移酶(S-adenosyl-L-methionine: delta24-sterol-C-methyltransferase)、type II过氧化物酶(type IIperoxiredoxin,POD)、丁酸-辅酶A连接酶(butyrate--CoA ligase AAE11);渗透调节物质合成相关基因:蔗糖合成酶(Sucrose synthase)、蔗糖磷酸合酶(Sucrosephosphate synthase)、棉籽糖合成酶(Raffinose synthase)、水苏糖合成酶(Stachyosesynthase)、△-吡咯啉-5-羧基合成酶(△1-pyrroline-5-carboxylate synthase)、鸟氨酸-△-氨基转移酶(Ornithine-delta-aminotransferase)、△-吡咯啉-5-羧基还原酶(Pyrroline-5-carboxylate reductase)、谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase)、乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)、胆碱单加氧酶(Choline monooxygenase)、水孔蛋白(Aquaporin);激素合成相关基因:9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,NCED)、ABA-醛氧化酶(ABA aldehyde oxidase)、细胞色素P450、赤霉素-20-氧化酶(Gibberellin20-oxidase)、12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxophytodienoic acid10,10-reductase)。
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