非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球慢性肝病最常见的形式,以脂肪变性与胰岛素抵抗（IR）为典型特征,能引起多种并发症及其相关死亡。NAFLD的常见病因有乙型肝炎病毒（HBV）感染,其通过x蛋白（HBx）诱导肝脂肪变性和IR等症状。IR发生伴随肝脏糖原磷酸化酶（PYGL）活性增加促进糖原（Gn）分解。而且IR与内质网（ER）应激及其自噬密切相关,ER应激是HBV引起NAFLD的重要病理机制,通过活化转录因子4抑制胰岛素受体底物1（IRS-1）信号传导而促进IR。内质网自噬调节因子1（FAM134B）作为ER驻留蛋白,通过参与溶酶体（Lyso）介导应激/损伤ER的分解代谢以维持ER稳态。ER是EVs重要的膜来源,溶酶体降解以抑制细胞外囊泡（EVs）生物学发生,自噬紊乱促进肝细胞释放EVs引起肝星状细胞（HSCs）活化,介导肝纤维化。综上,ER自噬（ER-phagy）是否通过调节肝细胞Gn代谢及EVs释放,介导肝细胞INS敏感性下降及肝星状细胞活化,参与HBV/HBx诱导NAFLD损伤的现象和调控机制尚待阐明。目的:为探明HBV感染/HBx表达关联性NAFLD中FAM134B依赖性ER-phagy的调控作用和分子机制;建立HBx表达诱导人肝细胞INS敏感性下降和HSCs活化的体内、外试验模型,探讨FAM134B介导ER-phagy参与CD63相关性EVs-Lyso降解通路调节EVs释放,探索FAM134B调节RBPs介导miR-122等分拣进入EVs和经由EVs诱导HSCs活化的功能学作用;为阐明FAM134B介导的ER自噬体与Lyso互话通讯在HBx诱导肝细胞EVs释放和细胞间通讯中的分子机制和靶向干预提供线索和理论依据。方法:（1）数据库分析:筛选GEO数据库,分析HBV感染人群肝脏组织样本中自噬相关基因（FAM134B、SQSTM1、LC3B）与EVs标志蛋白相关TSG101基因相对转录水平和相关性。进行GSEA、PPI数据分析,分析人群中FAM134B、HBx等基因表达水平与EVs生物学发生与释放、糖原代谢、肝纤维化等基因集的相关性。（2）体外（细胞）试验:给予人肝癌HepG2细胞pcDNA3.1-HBV、pGEM-HBx、pGEM-HBV-x-NULL或对照质粒（1.0μg）转染8 h,带有Tet-ON开关（可受DOX诱导表达）的HepG2-Tet-ON-HBx 细胞给予 DOX（0.25,0.5,1.0,2.0,4.0μg/mL）处理 24 h,建立 HBx 表达模型;给予INS（0.2 IU/mL,0.5 h）处理建立INS诱导模型;给予棕榈酸（PA,120μmol/L,24 h）处理建立IR阳性细胞模型;采用HepG2.2.15细胞转染HBx单克隆抗体（anti-HBx）表达质粒干预HBx表达;采用LX2细胞验证HSCs活化水平;采用自噬抑制剂CQ（10μmol/L,24 h）、自噬激动剂 CCCP（15 μmol/L,24 h）、RAPA（10 μg/L,24 h）、ATF4小、干扰RNA（siATF4）、FAM134B小干扰RNA（siFAM134B）干预模型进行验证;采用CRISPR/Cas9技术构建稳定低表达FAM134B的HepG2-Cas9-FAM134B及其对照细胞。检测指标和方法如下:①试剂盒法测定细胞内甘油三酯（TG）、糖原（Gn）、葡萄糖（Glc）和ATP含量水平,糖原合酶（GCS）和糖原磷酸化酶a（GPa）活性等;细胞Gn-PAS染色观察细胞内Gn分布情况;②qRT-PCR检测HBx RNA、ER应激相关蛋白（PERK、ATF4、ATF6等）和EVs标志蛋白（TSG101、CD63）等的基因mRNA水平;③蛋白免疫印迹（WB）测定细胞内INS调控的下游蛋白ADIPOQ、IRS-1,ER应激蛋白,ER-phagy溶酶体通路相关蛋白 FAM134B、LC3B、p62、LAMP2,mTOR、p-mTOR,EVs 标志蛋白 TSG101、CD63,LX2活化蛋白α-SMA等表达水平;④免疫荧光（IF）染色和激光共聚焦显微镜观察 ER（ER-Tracker 标记）与 Lyso（Lyso-Tracker 标记）及其相关蛋白 FAM134B、LC3B、PYGL、TSG101、CD63共定位情况,且以mTagRFP-mWasabi-LC3B质粒分析自噬流状态;⑤透射电子显微镜（TEM）观察ER形态及其ER-phagy结构;⑥邻位连接实验（PLA）测定肝细胞FAM134B与CD63的空间位置邻近水平;⑦免疫共沉淀（Co-IP）测定FAM134B与PYGL、CD63的相互作用;⑧超速离心法及试剂盒法提取EVs成分,动态光散射纳米粒度技术（DLS）鉴定EVs分布,TEM观察EVs形态;⑨CD63-ELISA测定EVs释放水平;划痕试验测定LX2细胞的迁移能力。（3）体内试验:采用10-12周龄HBx转基因（HBx-Tg）小鼠和野生型（WT）C57BL/6小鼠,分组和处理采用胆碱缺乏高脂饲料（CD）喂养,同时使用siFAM134B尾静脉注射进行干预,于小鼠饲养第11周起每三天注射8nmol,共5次,于第13周处死。小鼠血清样本和肝组织样本等进行如下检测:①Glc耐量试验（IPGTT）测定各组小鼠INS对Glc敏感性;INS耐受试验（ITT）测定各组小鼠的INS敏感性;②组织甘油三酯（TG）酶法测定各组小鼠的肝组织TG水平;③组织糖原（Gn）含量检测试剂盒测定各组小鼠的肝组织Gn水平;④组织ATP试剂盒测定各组小鼠的肝组织能量供应水平;⑤qRT-PCR测定小鼠肝组织ER-phagy相关基因（Retreg1、Atg5、Sqstm1、Map1lc3b）、肝星状细胞活化相关基因（Col-1、Acta2）基因 mRNA 水平;细胞外囊泡 miRNAs（miR-21a、miR-122、miR-155、miR-203、miR-205、miR-233）和RNA结合蛋白相关基因等基因表达水平;⑥WB测定ER-phagy、肝星状细胞活化、细胞外囊泡相关蛋白;⑦动物活体超声成像（US）测定小鼠肝纤维化影像;⑧免疫组化（IHC）测定小鼠肝组织中α-SMA的表达与分布;天狼星红染色测定小鼠肝纤维化水平;H＆E试验测定小鼠肝损伤形态学;⑨CD63-ELISA测定细胞外囊泡释放水平;⑩超速离心法分离肝组织EVs,TEM和DLS观察EVs形态及鉴定纯度。结果:（1）数据库分析:GEO数据库（GSE83148）分析显示,与正常对照（n=6）相比,HBV感染者（n=122）肝组织样本中SQSTM1及LC3B基因水平升高,提示HBV感染肝组织存在自噬流现象;且FAM134B基因水平降低、TSG101明显升高,二者呈显著性负相关（均P＜0.05）,提示HBV感染肝组织中FAM134B与EVs生物发生的潜在关联性。GSEA分析显示,与对照组相比,HBx高表达的HepG2细胞样本中,肝纤维化、糖原分解及EVs生物学发生等通路相关基因存在显著富集;与对照组相比,FAM134B表达的人群样本中,ER应激、EVs生物学发生及转运等通路相关基因存在显著富集,提示HBx表达与肝纤维化、糖原分解及EVs生物学发生具有显著相关性,FAM134B与ER应激、EVs生物学发生及转运具有显著相关性。PPI分析显示,FAM134B介导的ER-pahgy与EVs、肝纤维化等通路具有潜在关联性,存在蛋白相互作用的调控机制。（2）HBx表达诱导肝细胞INS敏感性下降:①与空白对照组相比,INS处理肝细胞中Gn水平、ATP水平和GCS活性显著升高（P＜0.05）,Glc水平和GPa酶活性显著降低（P＜0.05）,提示肝细胞INS诱导模型建立,肝细胞具有INS敏感性。②与对照组（INS处理组）细胞相比,HBx表达组HepG2细胞中Gn水平和ATP水平显著降低（P＜0.05）,TG水平和GPa活性升高（P＜0.05）,IR 阳性模型PA处理组具有相同的结果,提示HBx表达促进Gn分解,降低INS敏感性,引起脂质蓄积增多。③与对照组相比,HBx表达组HepG2细胞中,IF显示ER（即绿色荧光焦点）和PYGL蛋白水平（即红色荧光焦点）升高,两者共定位水平（即黄色荧光焦点）升高,提示HBx表达肝细胞中PYGL合成增加。④与对照组（INS处理组）细胞相比,siATF4干预HBx表达组HepG2细胞中Glc水平显著降低（P＜0.05）,提示ER应激参与肝细胞IR表型。⑤与对照组相比,HBx表达组HepG2细胞中PERK、ATF4等mRNA表达水平和蛋白水平升高,提示HBx表达诱导肝细胞ER应激。⑥与对照组相比,HBx表达组HepG2细胞中ADIPOQ、IRS-1蛋白水平降低,自噬抑制剂CQ处理具有相同的现象,siATF4干预HBx表达组HepG2细胞中p-mTOR、mTOR、p62等蛋白水平显著降低,提示ER应激介导的INS敏感性下降与自噬抑制有关。⑦与对照组相比,siFAM134B干预HBx表达组HepG2细胞中PERK、IRE1等蛋白水平显著升高,提示siFAM134B导致ER-phagy被阻断,错误蛋白聚集,增强HBx表达肝细胞中UPR和ER应激。⑧与对照组（INS处理组）细胞相比,siFA M134B干预HBx表达组HepG2细胞中Gn水平显著降低（P＜0.05）,HepG2-Cas9-FAM134B细胞中TG水平升高（P＜0.05）,Gn水平显著降低（P＜0.05）,提示ER-phagy抑制引起肝细胞脂质蓄积和INS敏感性下降。⑨与对照组相比,HBx表达HepG2细胞中Co-IP显示FAM134B表达水平升高,且与PYGL结合程度增强,提示HBx表达肝细胞FAM134B与PYGL存在相互作用。（3）FAM134B参与ER-phagy介导的ER-Lyso细胞器间通讯:与对照组相比,HBx表达肝细胞中:①IF显示Lyso与ER共定位（即黄色荧光焦点）降低（P＜0.05）,TEM显示ER扩张且溶酶体吞噬ER的现象降低,RAPA处理组则观察到溶酶体吞噬ER的自溶体结构,提示HBx表达抑制肝细胞ER-phagy。②IF显示FAM134B与LC3B共定位（即黄色荧光焦点）升高,p62蛋白（即绿色荧光焦点）水平显著升高,mTagRFP-mWasabi-LC3B呈现黄色荧光焦点;WB显示FAM134B、p62、LC3B等自噬相关蛋白水平均随HBx诱导表达呈剂量依赖性升高,以CQ处理组阻断ER-phagy的结果作对比,提示HBx表达促进肝细胞ER自噬体形成但抑制自噬货物蛋白降解,进而抑制FAM134B介导的ER-phagy。③LAMP2随HBx诱导表达呈剂量依赖性降低。提示HBx表达肝细胞可能抑制溶酶体形成。（4）HBV/HBx表达促进EVs释放介导HSCs活化:与对照组相比,HBx表达HepG2细胞中:①TSG101、CD63等mRNA表达水平随HBx诱导表达呈剂量依赖性升高,p-mTOR、mTOR、FAM134B、TSG101、CD63等蛋白水平升高,LAMP2蛋白水平降低,CQ处理组具有相同的结果,提示HBx表达肝细胞抑制ER-phagy,促进细胞外囊泡相关蛋白生成。②IF显示ER（即绿色荧光焦点）和TSG101蛋白水平（即红色色荧光焦点）升高,两者共定位水平（即黄色荧光焦点）升高,Lyso与TSG101共定位（即黄色荧光焦点）显著降低（P＜0.05）,提示HBx表达促进肝细胞TSG101合成增加,溶酶体降解细胞外囊泡相关蛋白能力减弱。③siFAM134B干预后TSG101、CD63等蛋白水平升高,HepG2-Cas9-FAM134B细胞中CD63蛋白水平显著升高,提示FAM134B参与HBx表达肝细胞促进细胞外囊泡生成与CD63有关。④IF显示FAM134B与CD63共定位水平（即黄色荧光焦点）显著升高,PLA显示FAM134B和CD63之间空间位置邻近的红色荧光焦点体积和数量显著升高,Co-IP显示FAM134B表达水平升高,且与CD63结合程度增强,提示HBx表达肝细胞FAM134B与CD63存在直接相互作用。⑤与对照组相比,HBV表达HepG2.2.15细胞CD63释放水平显著升高,siFAM134B干预组具有相同的结果,anti-HBx干预组则引起CD63释放水平显著降低,同时HBx表达HepG2细胞组CD63释放水平显著升高,EVs抑制剂GW4869处理引起CD63释放水平显著降低（P＜0.05）,提示HBx诱导HBV表达肝细胞细胞外囊泡的释放,HBx抑制FAM134B介导的ER-phagy起到调控作用。⑥超速离心法提取HBx表达的HepG2-Tet-ON-HBx细胞及对照组的EVs,TEM和DLS鉴定直径分布于100 nm左右杯状结构囊泡;EVs中TSG101、CD63且FAM134B等蛋白水平随HBx呈剂量依赖性升高,提示HBx表达肝细胞促进ER相关性细胞外囊泡释放。⑦与HepG2细胞共培养的LX2细胞相比,HepG2.2.15细胞共培的LX2细胞α-SMA蛋白表达水平升高,迁移能力增强,提示HBV表达肝细胞促进肝星状细胞活化。⑧PKH67标记EVs,活细胞成像显示LX2细胞对EVs具有吞噬作用;qRT-PCR显示提取HepG2.2.15的EVs中miR-122、miR-233、miR-203等基因表达水平显著升高,HepG2.2.15细胞中YBX1、MEX3A、MEX3B、MEX3C等RBPs的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）,提示YBX1、MEX3B等RBPs可能参与分选HBV表达HepG2.2.15细胞释放ER相关性的miRNAs,促进肝星状细胞活化。⑨超速离心法提取HepG2.2.15细胞及对照组的EVs,与Ctrl-EVs作用的LX2细胞相比,HBV-EVs作用的LX2细胞TGFB1、ACTA2、C,OL1A1等活化相关基因水平显著升高（P＜0.05）,α-SMA蛋白表达水平升高,迁移能力增强,提示HBV表达肝细胞释放细胞外囊泡促进肝星状细胞活化。（5）体内试验评价HBx表达诱导的IR及肝脏损伤:与对照组WT小鼠相比,HBx-Tg小鼠中:①IPGTT显示HBx-Tg小鼠组血糖曲线、AUC、HOMA-IR、肝脏TG水平显著升高;肝脏Gn水平和ATP水平显著降低（P＜0.05）;提示HBx-Tg小鼠具有肝脂肪变性和 IR。②WB 显示自噬蛋白 COX-2、ATF4、FAM134B、p62、TSG101、CD63、α-SMA蛋白水平显著上升,提示HBx-Tg小鼠促进ER应激并且抑制ER-phagy,同时促进EVs相关蛋白生成,引起肝星状细胞活化。CD饮食的HBx-Tg小鼠和siFAM134B干预的HBx-Tg小鼠中:上述实验结果效应增强（P＜0.05）,同时显著增强小鼠肥胖水平,提示CD饮食和siFAM134B干预能促进肝脂肪变性、IR和EVs生物学发生;MAM分离实验证实HBx-Tg小鼠促进肝细胞PYGL经ER转运至MAM,调控能量代谢。③TEM显示HBx-Tg小鼠肝细胞ER扩张并且呈现碎片化,线粒体膨胀且空泡化水平显著升高,嵴结构消失,脂滴数量明显升高,提示HBx-Tg小鼠肝细胞ER和线粒体损伤水平升高,具有脂肪变性的现象;IF显示HBx-Tg小鼠促进肝细胞FAM134B与CD63相互作用。④US显示HBx-Tg小鼠组肝形态增大,回声灶增多;IHC显示肝组织空泡化增多,α-SMA蛋白水平升高;天狼星红显示肝组织胶原沉积升高;H＆E显示脂滴水平显著升高,空泡化和肝细胞破碎程度升高;提示HBx-Tg小鼠肝纤维化。⑤CD63-ELISA显示HBx-Tg小鼠血清和肝脏CD63释放水平显著升高（P＜0.05）;超速离心法分离HBx-Tg小鼠小鼠肝脏EVs,TEM和DLS显示直径分布于100 nm左右杯状结构囊泡增多;WB显示EVs含有FAM134B蛋白水平升高,提示HBx-Tg小鼠促进ER相关性EVs的释放。⑥HBx-Tg小鼠肝细胞YBX1、MEX3B的mRNA表达水平升高;EVs内的miR-122、miR-155、miR-203表达水平显著升高（P＜0.05）;提示HBx-Tg小鼠ER相关性细胞外囊泡释放miRNAs促进肝纤维化发生,RBPs可能起到调控作用。CD饮食的HBx-Tg小鼠和siFAM134B干预的HBx-Tg小鼠中:上述实验结果效应增强（P＜0.05）,此外Sqstm1、Map1lc3b等自噬基因水平明显升高（P＜0.05）,Col-1水平显著升高（P＜0.05）,提示CD饮食和siFAM134B干预能促进小鼠自噬体形成且引起自噬货物蛋白蓄积,显著增强小鼠细胞外囊泡相关性肝纤维化水平。结论:研究阐明FAM134B依赖性ER-phagy参与HBx表达肝细胞CD63相关性EVs-Lyso降解通路促进EVs释放,经由RBPs介导miR-122等分拣进入EVs介导HSCs活化的分子机制;同时阐明HBx表达肝细胞介导的ER应激相关性IR中,FAM134B依赖性ER-phagy-溶酶体通路对PYGL相关性Gn代谢的调控作用;结果为探明EVs-Lyso降解通路新靶标和作为HSCs活化早期标志及其靶向干预提供依据,揭示ER稳态及其自噬介导INS敏感性下降相关Gn代谢紊乱在NAFLD发生发展中的机制。