草菇是一种高温型的食用菌，在常规低温(4℃)条件下，其菌丝会发生自溶而死亡，子实体会发软、液化和腐烂。草菇的这一特性严重地限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷冻保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温贮藏。而且，草菇为同宗结合真菌，菌丝没有锁状联合，杂种选择缺乏标记，这给草菇的杂交育种带来极大的困难。基因工程技术的发展，报告基因转化丝状真菌的成功，抗冷冻蛋白基因克隆和转化的成功，为解决草菇抗低温这一难题提供了可能性。 抗冷冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一类具有降低生物体液冰点和抑制冰晶生长的生物活性蛋白，在低温生物的生存中起着重要的作用。目前，已从鱼类、昆虫、植物、真菌中分离了许多抗冷冻蛋白基因，而应用较多的是鱼类抗冷冻蛋白基因，它已广泛用于转化鱼类、植物等并得到了表达。然而某些昆虫抗冻蛋白具有很高的生物活性，如从云杉卷叶蛾中克隆的抗冷冻蛋白，其活性是目前所有已知北极鱼抗冷冻蛋白活性的10-30倍，甚至100倍，因而昆虫的抗冷冻蛋白基因(THP)日益受到重视。 本研究以AFP1和AFP2为引物，采用RT-PCR技术从Budworm(一种磷翅目昆虫的幼虫)的mRNA中分离得到THP基因，THP基因克隆进T-Vector载体形成质粒载体pGTHP4。同时做了以下研究： (1) 草菇对抗性标记试剂的敏感性测验：选择卡那霉素、潮霉素、遗传霉素(G418)、膦丝菌素(PPT)4种抗性标记试剂对两个同属不同种的草菇V1308(VB)和VQ进行敏感性测验。结果V1308和VQ均能在含有卡那霉素、G418、PPT的PDSA平板上生长，而在含潮霉素的PDSA上生长受抑制或完全不能生长，说明草菇只对潮霉素敏感； (2) 草菇对潮霉素的最低敏感浓度测定：选择草菇V1308、V1、和V34 3个菌株对潮霉素进行敏感性测定。结果表明，不同的草菇菌株对潮霉素的敏感性不同。这3种草菇对潮霉素的最低敏感浓度为：在固体培养基上，V1308、V1、V34分别为70、50、60μg／mL；在液体培养基上，V1308、V1、V34分别为50、35、40μg／mL。 (3)草菇基因枪法转化体系的建立：以含有35S启动子、GUS报告基因、潮霉素抗性基因的质粒pCAMBIA1301为草菇表达载体，采用基因枪转化法，设定不同的轰击参数，把外源GUS基因转化进草菇V1308的菌丝中。轰击后的菌丝经过3个阶段的筛选获得了转化子。转化子数经方差分析后表明，得到最多转化子的最佳基因枪转化参数是：氦气压力为1100Psi，真空压力为26inchesHg，靶距离为6cm，轰击次数为1次。转化子经GUS组织化学分析及Southern B！citing检测，结果表明了外源GUS基因已整合进草菇的基因组中，而且外源GUS基因在草菇基因组上的插入位点不同，拷贝数也不同。草菇转化子经出菇试验及子实体菌丝的GUS组织化学检测，证明了外源GUS基因在草菇基因组中的稳定整合及可遗传性。 （4）草菇表达载体的构建：以限制性内切酶BstEll和NCOI双酶解质粒pCAMBIA1301，回收含有355启动子、潮霉素抗性基因的大片段。以限制性内切酶BstZ和 NCOI双酶解质粒 pGTHP4，回收含有 THP目的基因的小片段。把回收的THP基因片段与pCAMBIA1301的大片段通过粘端连接后，再加入接头进行环化连接，形成了含有目的THP基因的草菇表达载体PCTH823。 （5）THP基因转化草菇V1308、VI和V34：以3mm见方的小菌块为外植体， 把质粒pCTH823包裹在金粉颗粒上，利用己建立好的草菇基因枪转化体系，把外 源THP基因转化进草菇菌株V1308、VI和V34。轰击后的菌丝经过3个阶段的潮 霉素抗性筛选后获得了1个V1308转化子、3个VI转化子和13个V34转化子。 选择 9个 V34转化子进行 PCR扩增鉴定及 Southern B！citing检测验证。结果表明， 外源THP基因己经整合进草菇的基因组上，而且外源THP基因在不同转化子基因 组上的插入位点不同，拷贝数也不相同。转化子经低温处理试验结果表明，这9个 转基因草菇对4’C低温的忍受时间比对照至少多7天。这个结果表明了外源THP 基因可在草菇的菌丝里表达。 （6）V34转化子的生物学特性观察：对 V34转化子菌丝和对照菌丝的平均生长速度进行方差分析表明，草菇转化子之间、草菇转化子与对照之间的平均生长速度存在极显著的差异。转化子的菌丝形态特征与对照相比产生了或多或少的变异，这表明了由于外源基因的插入改变了草菇的基因型，从而引起草菇表型的改变。