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背景与目的:干细胞具有多向分化潜能,在再生医学研究领域备受关注。通过诱导干细胞向神经方向分化,使其修复或替代病损细胞及组织,为神经系统疾病的治疗提供了一种新的策略。然而,要实现这一治疗策略的临床应用,需要利用无创的影像学手段对干细胞分化过程进行有效的监测和评估。目前用于干细胞监测的成像手段大致可分为三种,即光学成像、核医学成像和磁共振成像（MRI）,其中MRI因具有无辐射、组织穿透力强以及软组织对比度好等优点而被广泛应用。分子水平的MR成像研究常需借助于报告基因。目前MRI报告基因可分为编码酶的报告基因、编码细胞膜受体的报告基因和内源性报告基因等几种。铁蛋白基因（Ferritin）属内源性报告基因,是目前应用最为成熟和广泛的MRI报告基因之一。之前的研究中,我们已经利用FTH1报告基因对干细胞神经分化进行了MRI示踪研究,虽然实现了对干细胞分化过程的纵向长期监测,但显然不能有效区分神经分化前后的两种细胞,即无法明确干细胞神经分化这一事件发生的时间和空间信息。近年来,越多越多的证据显示,micro RNAs（miRNAs）密切参与了干细胞神经分化的调控过程。miRNA-124（miR-124）是神经细胞中表达最为丰富的miRNAs之一,在干细胞神经分化中miR-124的表达会发生明显变化。因此,基于miR-124在干细胞神经分化前后的表达差异,构建miR-124反应性的MRI报告基因系统,有可能实现对干细胞分化的动态监测。最近研究发现,miR-124可靶向并特异性结合于离子型谷氨酸受体AMPA2（GRIA2）的3’非翻译端（3’UTR）,从而抑制GRIA2的表达。受此启示,我们设想将FTH1的3’UTR替换为GRIA2的3’UTR（GRIA2 3’UTR）,使miR-124通过与改造后的FTH1 3’UTR特异性结合,来控制FTH1报告基因的表达,这样,报告基因表达的变化就反映了细胞内miR-124的含量,从而通过miR-124的动态变化水平来间接判断干细胞神经分化事件的发生。基于以上背景和设想,本研究拟利用GRIA2 3’UTR对FTH1报告基因进行改造,构建miR-124反应性的FTH1基因报告系统（FTH1-GRIA2 3’UTR）,将该基因报告系统转导至小鼠P19干细胞,对转基因P19干细胞进行成神经诱导分化,并在分化前后观察神经分化对报告基因表达的影响。期望在干细胞成神经分化后,细胞内miR-124表达增高,并特异性靶向结合于FTH1基因的GRIA2 3’UTR,进而抑制FTH1报告基因的表达。通过成神经分化前后细胞内报告基因表达的变化有可能实现MRI对细胞内miR-124动态变化的可视化,从而有效监测干细胞分化事件,同时也为感兴趣miRNA与目的基因的靶向关系研究提供一种无创的新型MRI分子影像学手段。方法:（1）双荧光素酶报告基因实验使用Target Scan在线靶基因预测miR-124与GRIA2 3’UTR是否存在结合位点。将预测序列构建入双荧光素酶报告基因系统,实验组共分为4组:GRIA2 3’UTR载体质粒+miR-124载体质粒;GRIA2 3’UTR空载质粒（GRIA2 3’UTR-NC）+miR-124载体质粒;GRIA2 3’UTR载体质粒+miR空载质粒（miR-NC）;GRIA2 3’UTR空载质粒（GRIA2 3’UTR-NC）+miR空载质粒（miR-NC）,用于验证miR-124靶向抑制GRIA2基因。同时把阳性对照组分为2组:TRAF6 3’U TR载体质粒+miR-146b载体质粒;TRAF6 3’UTR载体质粒+miR空载质粒（miR-NC）,用于验证整个转染检测体系是否可用有效。（2）Western blot检测FTH1表达构建质粒并转染293T细胞,使用Western blot重复三次检测FTH1-GRIA2 3’UTR结合miR-124后,FTH1是否受抑制。实验共分2组:FTH1-GRIA2 3’UTR载体质粒+miR-124载体质粒;FTH1-GRIA2 3’UTR载体质粒+miR空载质粒（miR-NC）。检测FTH1-GRIA2 3’U TR+miR-124组FTH1表达量是否低于FTH1-GRIA2 3’UTR+miR-NC组。（3）慢病毒载体构建使用上海吉凯基因化学技术有限公司设计的Age I/Nhe I酶对载体质粒GV367（Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin）进行双酶切,将人工合成的FTH1序列和GRIA2 3’UTR序列与载体连接、转化获得重组慢病毒载体质粒GV367-FTH1-GRIA2 3’UTR,并对长出的单克隆进行测序,鉴定构建成功后感染293T细胞,48h后收集病毒液,离心得到病毒并标记为CMV-FTH1-GRIA2 3’UTR,病毒分装后-80℃保存。采用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度,同时构建CMV-FTH1作为阳性对照,CMV-NC空载病毒作为阴性对照。（4）慢病毒转染P19细胞并筛选稳定株待P19细胞在孔板中汇合度达30%左右时,根据病毒转染适宜MOI值。添加含实验组CMV-FTH1-GRIA2 3’UTR、阳性对照组CMV-FTH1和空载组病毒的培养基,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。嘌呤霉素筛选稳定表达株,并分别命名为P19-FTH1-GRIA2 3’UTR、P19-FTH1、P19-NC。（5）P19细胞成神经诱导分化及鉴定以8 d为一个分化周期,将P19-FTH1-GRIA2 3’UTR、P19-FTH1细胞加入含终浓度为10μM的at RA培养基悬浮培养4 d,将诱导分化第4 d的细胞重悬,离心后在多聚赖氨酸包被的培养皿中以无at RA的完全培养基维持分化4 d。通过镜下观察第0、4、8 d细胞形态变化,取第8 d的细胞进行免疫荧光染色,PCR检测第0、2、4、6、8 d细胞内miR-124表达量变化,通过以上三种方法来验证是否成功分化出Neurons-FTH1-GRIA2 3’UTR、Neurons-FTH1细胞。（6）细胞分化前后聚铁能力和FTH1表达检测通过普鲁士蓝染色、铁含量试剂检测盒检测细胞内铁含量。通过Western blot、MR体外成像检测细胞神经分化前后FTH1的表达和T2WI信号变化、R2值变化。结果（1）双荧光素酶报告基因实验Target Scan在线靶基因分析miR-124与GRAI2基因3’UTR区域存在结合位点。双荧光素酶实验结果显示GRIA2 3’UTR+miR-124组较G RIA2 3’UTR-NC+miR-124组荧光素酶活性明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。同时,阳参质粒TRAF6 3’UTR+miR-146b组较T RAF6 3’UTR+miR-NC组荧光素酶活性明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明转染检测体系无异常。（2）Western blot检测FTH1表达结果显示在293T细胞内FTH1-GRIA2 3’UTR+miR-124组FTH1表达量低于FTH1-GRIA2 3’UTR+miR-NC组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）慢病毒载体的构建、鉴定及病毒包装经过载体酶切、目的基因片段的获取、重组载体构建（PCR鉴定）、测序等证明已成功构建所需CMV-FTH1-GRIA2 3’UTR和CMV-FTH1慢病毒载体,病毒滴度为1.5×109TU/m L。（4）获取细胞稳转株经过慢病毒转染72小时后镜下观察有明显绿色荧光表达后,使用2μg/m L嘌呤霉素筛选7天,浓度减半再筛选3天。成功获得P19-FTH1-GRIA2 3’UTR、P19-FTH1、P19-NC稳定株。（5）P19细胞的成神经分化鉴定显微镜下观察到P19-FTH1-GRIA2 3’UTR、P19-FTH1细胞在第0d时呈贴壁状态,部分细胞为克隆样。at RA诱导第4 d时细胞逐渐成团生长,形成边界清晰的球状拟胚体。在完全培养基维持分化条件下,细胞在第8 d时形态开始向神经元转变,可见突触形成。免疫荧光染色对分化后细胞进行鉴定,荧光显微镜下观察发现细胞TUJ1染色阳性。PCR显示miR-124表达量随分化天数增加而递增。成功分化出Neuron s-FTH1-GRIA2 3’UTR、Neurons-FTH1细胞。（6）神经分化前后细胞FTH1表达及聚铁效应普鲁士蓝染色观察到P19-FTH1-GRIA2 3’UTR组、P19-FTH1组、Neurons-FTH1组细胞内存在铁颗粒,Neurons-FTH1-GRIA2 3’UTR组细胞存在少量铁颗粒,在P19-NC组内无明显铁颗粒。铁试剂检测盒检测结果显示Neurons-FTH1-GRIA2 3’UTR组细胞内铁含量明显低于P19-FTH1-GRIA2 3’UTR组,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示P19-FTH1-GRIA2 3’UTR组、P19-FTH1组、Neurons-FTH1组可大量表达铁蛋白,Neurons-FTH1-GRIA2 3’UTR组表达少量铁蛋白,P19-NC组不表达铁蛋白,差异具有统计学意义（P<0.05）。MRI扫描显示Neurons-FTH1-GRIA2 3’UTR细胞T2WI信号较P19-FTH1-GRIA2 3’UTR细胞明显升高。Neurons-FTH1-GRIA2 3’UTR细胞T2WI较P19-FTH1-GRIA2 3’UTR细胞R2值显著下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论利用miR-124与GRIA2 3’UTR靶向结合的特性,通过基因改造成功构建了miR-124反应性的基因报告系统FTH1-GRIA2 3’UTR。P19干细胞成神经分化后miR-124表达明显增多,并特异性靶向结合于FTH1基因报告系统的GRIA2 3’UTR,从而有效抑制FTH1基因表达,并引起MRI信号变化。本研究证实了miR-124反应性报告基因MR成像用于显示细胞内miR-124的可行性,为干细胞成神经分化提供了一种新的成像方法,同时也为研究感兴趣miRNA和待测目的基因的靶向关系拓展了新的思路。