论文部分内容阅读
【目的】
1.研究SMPD1基因敲除鼠认知功能障碍的发生发展。
2.明确SMPD1对细胞膜微粒(MVs)的调控作用，探索SMPD1调控的MVs对认知功能的影响。
【方法】
建立SMPD1基因敲除(SMPD1-/-)的C57BL/6小鼠，免疫荧光检测SMPD1-/-小鼠及同窝出生的野生型(SMPD1+/+)小鼠SMPD1基因调控酸性鞘磷脂酶(ASMase)的表达量，观察它们自然生长过程中的生理病理变化。其中，水迷宫监测不同周龄SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠认知功能，纳米颗粒分析仪监测不同周龄SMPD1-/-小鼠和SMPD1+/+小鼠经梯度离心法获得的外周血MVs粒径及数量变化。
在SMPD1-/-小鼠6周龄时分别予以纯PBS、未发病SMPD1基因敲除小鼠(6w)外周血MVs、已发病SMPD1基因敲除小鼠(24w)外周血MVs、野生型小鼠外周血MVs尾静脉输注，MVs浓度为107个/100μl，注射量为100μl，注射频率为4天/次。即分为SMPD1-/-+PBS组小鼠、SMPD1-/-+N(Non-onset)组小鼠、SMPD1-/-+O(Onset)组小鼠、SMPD1-/-+W(SMPD1+/+,Wild-type)组小鼠。以不做任何处理的SMPD1-/-小鼠和SMPD1+/+小鼠，作为上述小组的空白对照组。直至小鼠12周龄后分别对它们进行旷场实验比较自发性活动及焦虑情绪、水迷宫实验评估认知记忆功能、尼氏染色检测海马CA1区尼氏小体数量、衰老染色分析海马CA3区衰老神经元数目、免疫荧光染色检测大脑皮层以及海马CA1区神经元平均光密度，以探索补充不同状态的MVs及SMPD1调控的MVs能否延缓神经损伤、改善认知功能障碍。
【结果】
1.免疫荧光检测SMPD1基因调控的蛋白表达量，敲除掉SMPD1基因后SMPD1-/-小鼠大脑皮层无表达ASMase。
2.水迷宫监测不同周数SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠认知情况，与SMPD1+/+小鼠相比，6w时SMPD1-/-小鼠潜伏期时间无差异；9w时SMPD1-/-小鼠潜伏期时间延长，但未达到统计学差异；12w时SMPD1-/-小鼠潜伏期时间明显延长(P＜0.05)；24w后SMPD1-/-小鼠潜伏期时间显著延长(P＜0.01)。
3.追踪监测SMPD1-/-小鼠存活天数以及体重，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比寿命减短(P＜0.01)，自37w起体重明显下降。
4.SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠外周血中MVs粒径均为100nm-500nm；追踪监测SMPD1-/-小鼠外周血中MVs水平，发现其MVs数目从6w开始明显降低(P＜0.01)。
5.旷场实验中各组小鼠之间相互比较，自发性活动均无统计学差异。SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，中央区活动时间及中央区路程均下降(P＜0.01)，周边时间增加(P＜0.05)，表现出焦虑情绪。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠周边区活动时间均减少(P＜0.05)，且中央区活动时间及中央区路程明显增多(P＜0.05及P＜0.01)，小鼠趋避性及焦虑水平降低；SMPD1-/-+O组小鼠仅表现为周边区活动路程缩短。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
6.水迷宫数据显示，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，潜伏期时间显著延长，穿越平台次数明显减少(P＜0.01)。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠潜伏期时间缩短，穿越平台次数增加(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠虽潜伏期时间略有缩短与穿越平台次数稍增加，但无统计学差异。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
7.经尼氏染色后发现，在海马CA1区中，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，尼氏小体丢失数量增加(P＜0.01)。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠尼氏小体丢失数量减少(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠尼氏小体丢失数量有所减少，但无统计学差异；SMPD1-/-+W组小鼠尼氏小体丢失数量明显减少(P＜0.01)。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
8.在海马CA3区中，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，衰老神经元数目显著增加(P＜0.01)。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠衰老神经元数目均减少(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠衰老神经元数目有所减少，但未达到统计学差异。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
9.免疫荧光结果显示，在大脑皮层以及海马CA1区中，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，神经元显著缺失。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠神经元平均光密度值增高(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠神经元平均光密度值虽有所增高，但未达到统计学差异。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
【结论】
1.SMPD1基因缺失可致寿命减短，随着年龄的增长逐渐出现体重下降、认知障碍及焦虑情绪的产生。
2.SMPD1调控的MVs能够延缓小鼠神经功能损伤及认知功能障碍。
1.研究SMPD1基因敲除鼠认知功能障碍的发生发展。
2.明确SMPD1对细胞膜微粒(MVs)的调控作用，探索SMPD1调控的MVs对认知功能的影响。
【方法】
建立SMPD1基因敲除(SMPD1-/-)的C57BL/6小鼠，免疫荧光检测SMPD1-/-小鼠及同窝出生的野生型(SMPD1+/+)小鼠SMPD1基因调控酸性鞘磷脂酶(ASMase)的表达量，观察它们自然生长过程中的生理病理变化。其中，水迷宫监测不同周龄SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠认知功能，纳米颗粒分析仪监测不同周龄SMPD1-/-小鼠和SMPD1+/+小鼠经梯度离心法获得的外周血MVs粒径及数量变化。
在SMPD1-/-小鼠6周龄时分别予以纯PBS、未发病SMPD1基因敲除小鼠(6w)外周血MVs、已发病SMPD1基因敲除小鼠(24w)外周血MVs、野生型小鼠外周血MVs尾静脉输注，MVs浓度为107个/100μl，注射量为100μl，注射频率为4天/次。即分为SMPD1-/-+PBS组小鼠、SMPD1-/-+N(Non-onset)组小鼠、SMPD1-/-+O(Onset)组小鼠、SMPD1-/-+W(SMPD1+/+,Wild-type)组小鼠。以不做任何处理的SMPD1-/-小鼠和SMPD1+/+小鼠，作为上述小组的空白对照组。直至小鼠12周龄后分别对它们进行旷场实验比较自发性活动及焦虑情绪、水迷宫实验评估认知记忆功能、尼氏染色检测海马CA1区尼氏小体数量、衰老染色分析海马CA3区衰老神经元数目、免疫荧光染色检测大脑皮层以及海马CA1区神经元平均光密度，以探索补充不同状态的MVs及SMPD1调控的MVs能否延缓神经损伤、改善认知功能障碍。
【结果】
1.免疫荧光检测SMPD1基因调控的蛋白表达量，敲除掉SMPD1基因后SMPD1-/-小鼠大脑皮层无表达ASMase。
2.水迷宫监测不同周数SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠认知情况，与SMPD1+/+小鼠相比，6w时SMPD1-/-小鼠潜伏期时间无差异；9w时SMPD1-/-小鼠潜伏期时间延长，但未达到统计学差异；12w时SMPD1-/-小鼠潜伏期时间明显延长(P＜0.05)；24w后SMPD1-/-小鼠潜伏期时间显著延长(P＜0.01)。
3.追踪监测SMPD1-/-小鼠存活天数以及体重，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比寿命减短(P＜0.01)，自37w起体重明显下降。
4.SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠外周血中MVs粒径均为100nm-500nm；追踪监测SMPD1-/-小鼠外周血中MVs水平，发现其MVs数目从6w开始明显降低(P＜0.01)。
5.旷场实验中各组小鼠之间相互比较，自发性活动均无统计学差异。SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，中央区活动时间及中央区路程均下降(P＜0.01)，周边时间增加(P＜0.05)，表现出焦虑情绪。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠周边区活动时间均减少(P＜0.05)，且中央区活动时间及中央区路程明显增多(P＜0.05及P＜0.01)，小鼠趋避性及焦虑水平降低；SMPD1-/-+O组小鼠仅表现为周边区活动路程缩短。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
6.水迷宫数据显示，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，潜伏期时间显著延长，穿越平台次数明显减少(P＜0.01)。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠潜伏期时间缩短，穿越平台次数增加(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠虽潜伏期时间略有缩短与穿越平台次数稍增加，但无统计学差异。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
7.经尼氏染色后发现，在海马CA1区中，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，尼氏小体丢失数量增加(P＜0.01)。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠尼氏小体丢失数量减少(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠尼氏小体丢失数量有所减少，但无统计学差异；SMPD1-/-+W组小鼠尼氏小体丢失数量明显减少(P＜0.01)。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
8.在海马CA3区中，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，衰老神经元数目显著增加(P＜0.01)。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠衰老神经元数目均减少(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠衰老神经元数目有所减少，但未达到统计学差异。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
9.免疫荧光结果显示，在大脑皮层以及海马CA1区中，SMPD1-/-小鼠与SMPD1+/+小鼠相比，神经元显著缺失。与SMPD1-/-小鼠相比，SMPD1-/-+N组小鼠及SMPD1-/-+W组小鼠神经元平均光密度值增高(P＜0.05)；SMPD1-/-+O组小鼠神经元平均光密度值虽有所增高，但未达到统计学差异。SMPD1-/-+N组小鼠与SMPD1-/-+W组小鼠相比无统计学差异。
【结论】
1.SMPD1基因缺失可致寿命减短，随着年龄的增长逐渐出现体重下降、认知障碍及焦虑情绪的产生。
2.SMPD1调控的MVs能够延缓小鼠神经功能损伤及认知功能障碍。