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目的:白血病是当前我国最常见的肿瘤之一,在儿童和青少年的恶性肿瘤中,白血病则占第一位。化疗或放疗仅可使一部分病人的症状得到缓解。造血干细胞移植使治愈白血病成为可能。由于供受者之间的HLA配型的相合性和年龄等问题,同种异体造血干细胞移植的广泛应用受到限制。自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplant,AHSCT)为不能进行异基因造血干细胞移植(allogeneic stem cell transplant ,Allo-SCT)的病人带来了治愈的机会,但AHSCT面临一个严峻问题:即移植后肿瘤的高复发率,而移植物中残留的微量肿瘤细胞克隆增殖是其复发的主要原因。因此,有效清除移植物中残留的肿瘤细胞已成为当前一个重要研究课题。近年来,随着光动力疗法(photodynamic therapy ,PDT)相关技术的快速发展,尤其是第二代光敏剂的出现,使得光敏剂在肿瘤细胞中具有更高的选择性聚集能力,吸收波长更长,产生更大范围内的杀伤,同时它的光毒性极小,因而副作用小,在净化骨髓移植物中显示出较强的实用价值。反义技术是基因治疗的一种方法。其原理是反义寡核苷酸与靶的mRNA序列专属性结合并抑制基因表达。大多数肿瘤细胞的基因表达形式与正常细胞不同,理论上反义寡核苷酸能被用于专属地靶向肿瘤相关基因,或变异基因,而不影响正常细胞的基因表达。因而使反义技术在净化骨髓移植物中也显示出良好的应用前景。近来随着基于PDT发展而来的光化学基因转染(photochemical gene transfection, PGT)新技术的逐步完善,反义寡核苷酸的细胞内转染得到明显增加,从而为反义寡核苷酸有效发挥其抑制基因表达的作用提供了有利条件。Bcr-abl融合基因是慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)来源的K562细胞株的标志基因,它由人22号染色体上bcr基因易位至9号染色体上的abl基因而形成,即:t(9;22),在细胞遗传上表现为特异的ph染色体。该融合基因可以在95%以上的CML患者中检测到,而正常人缺如,且其编码的P210bcr-abl蛋白在CML发病中起着决定性作用。P210是CML细胞生长的一种内在刺激物,而且还可能通过GRB(growth factor receptor bound protein-2)与ras信号途径发生偶联,造成细胞错误或过多传递信号,使细胞出现<WP=10>恶性增殖而凋亡减少。本实验中,我们观察 PDT联合反义寡核苷酸体外对K562细胞生长的影响。目的是探讨PDT和反义寡核苷酸的联合应用,是否协同干预K562细胞生长,为研究净化自体骨髓移植物的新途径提供实验基础。方法:1、细胞培养 人CML急性变K562细胞株,常规在RPMI1640培养液(含10%灭活新生小牛血清)中培养。2、实验分组:(1)HMME-PDT对bcr-abl融合基因反义寡核苷酸K562细胞转染影响实验分为2组:A组:实验组(加入HMME、荧光标记的AS ODN孵育6h,激光照射);B组:对照组(加入HMME、荧光标记的AS ODN孵育6h,不用激光照射)。其中荧光标记的AS ODN加样浓度分为4个梯度(0.15μmol·L-1、0.3μmol·L-1、0.6μmol·L-1、0.9μmol·L-1),HMME浓度为20 μg·ML-1 ,激光照射剂量为9 J·CM-2。(2)HMME-PDT联合AS ODN影响K562细胞生长体外实验分为8组:A组:正常对照组(不加HMME、反或错义寡核苷酸孵育6小时,不用激光照射);B组:光敏剂对照组(仅加HMME孵育6h,不用激光照射);C组:激光组(不加HMME、反、错义寡核苷酸孵育6小时,单纯激光照射);D组:光动力组(仅加HMME孵育6h,激光照射);E组:错义组(仅加错义寡核苷酸孵育6h,不用激光照射);F组:反义组(仅加反义寡核苷酸孵育6h,不用激光照射);G组:光动力+错义组(加HMME、错义寡核苷酸孵育6h,激光照射);H组:光动力+反义组(加HMME、反义寡核苷酸孵育6h,激光照射)。其中激光照射剂量为9 J·CM-2、光敏剂加样浓度为20 μg·ML-1,AS ODN及Mismatched ODN的加样浓度均为0.9μmol·L-1。(3)HMME-PDT联合AS ODN对K562细胞bcr-abl融合基因mRNA表达影响的实验分为8组:同(2)。3、PDT实验方法:(1)激光器 为半导体激光器,输出波长为650 nm, 距光斑3cm处输出功率15mW;(2)照射剂量 为9 J·CM-2;(3)照射角度 垂直照射;(4)照射条件 暗室中进行。4、荧光标记AS ODN的细胞摄入率及胞内平均荧光强度(流式细胞仪)。5、荧光标记AS ODN转染K562细胞后观察胞内荧光物质的分布并拍照(荧光显微镜)。结果判断:荧光显微镜下观察(×200或400),胞浆或胞核内出现荧光物质为阳性。胞浆或胞核内无荧光物质为阴性。6、HMME-PDT联合AS ODN 作用K562细胞后的形态观察(倒置相差显微镜)。7、HMME-PDT联合AS ODN 对K562细胞增殖和存活的影响(台盼蓝拒染实验、细胞计数)。8、HMME-PDT联合AS ODN 对K562细胞克隆形成的影响(软琼脂克隆形成实验)。9、HMME-PDT联合AS ODN 作用前后K562细胞周期的变化(流式细胞仪)。10、HMME-PDT联合AS ODN促K562细胞凋亡的观察(原位细胞凋亡检测)。11、HMME-PD联合AS ODN对K562细胞bcr-abl融合基因mRNA表达的影响(RT-PCR)。12、统计学处理:所有<WP=11>数据以均数±标准差(±s)或百分数表示,组间比较分别采用SPSS10.0软件行单因素方差分析和t检验。结果: 1、荧光标记AS ODN的细胞摄入率及胞内平均荧光强度:在不用阳离子脂质体预构建转运复合体的情况下,HMME-PDT可以明显增加K562细胞对反义bcr-ab