柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是一种由革兰氏阴性细菌韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）引起的重要检疫病害。该病病原分为三个亚种:“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas,亚洲种）、“Ca.L.africanus”（CLaf,非洲种）和“Ca.L.americanus”（CLam,美洲种）。其中,CLas和CLam由亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）传播,而CLaf则是由非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）传播。目前对该病害的防控还没有有效的药剂,商业化柑橘品种对该病均没有抗性,当前防控主要通过控制木虱传播、及时砍除病树和使用无病苗木。黄龙病菌尚不能离体培养,难以进行传统的分子和遗传操作,因此极大制约了对黄龙病菌毒力机制的认知。随着生物信息学的发展,2009年公布了首个CLas株系的全基因组序列,为后续研究奠定了基础。效应蛋白是由病原菌编码产生的一类重要蛋白,根据其在寄主细胞的定位可分为胞外效应蛋白（Apoplastic effectors）和胞内效应蛋白（Intracellular effectors）,在某些情况下也被称为毒力因子,是病原菌侵染寄主的重要武器。生物信息学分析表明,黄龙病菌基因组具有完整的Sec分泌途径,预测的166个假定效应蛋白中有86个通过实验被证实含有信号肽,其中44个在植物和木虱差异表达,表明这些蛋白可能参与病原对不同宿主的响应。迄今为止,关于Sec依赖途径的分泌蛋白的研究鲜有报道,因此有必要开展相关研究,为该病害的防控奠定理论依据。本研究以前期筛选的候选分泌蛋白Clsp33为研究对象,在生物信息学分析基础上,构建了胞外分泌验证系统,初步鉴定了其分泌特性;利用RT-qPCR分析了Clsp33在柑橘和木虱中的相对表达量;通过构建植物表达载体,解析了Clsp33的亚细胞定位和生物学功能;通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）对初步筛选到的互作蛋白进行了验证,以期解析Clsp33的致病机制。获得的主要研究结果如下:1、参照NCBI中Candidatus Liberibacter asiaticus str.psy62的Clsp33核酸序列和氨基酸序列,将其导入NCBI进行Blast分析,结果表明Clsp33具有高度保守性。利用TMHMM Server v.2.0和signal 4.1 Server在线网站对Clsp33进行跨膜结构域和信号肽分析,结果表明该蛋白不具有跨膜结构域但具有典型的信号肽,长度为20aa。2、利用碱性磷酸酶（phoA）分泌特性成功构建了胞外分泌验证系统。将Clsp33信号肽与缺失了信号肽的phoA进行融合表达,转化大肠杆菌BL21后菌落在LB选择培养上均呈现了蓝色,与表达了phoA完整蛋白的菌落相似,Clsp33信号肽成功促使了phoA的分泌,表明Clsp33具有分泌能力。3、通过RT-qPCR对染病甜橙和带毒木虱中的Clsp33进行了相对表达量分析,发现该基因在甜橙中的表达量约为木虱中的6倍,说明该候选蛋白在植物宿主中可能作为潜在的效应子。4、通过构建植物表达载体对Clsp33进行了亚细胞定位分析。25℃处理下Clsp33在本氏烟表皮细胞的细胞核和细胞质中均有广泛分布,而32℃高温处理则明显限制了其进入细胞核中的数量;Clsp33核定位信号序列中五处酪氨酸K₅₂、K₆₃、K₆₄、K₇₁和K₇₂的突变对其亚细胞定位没有明显影响;外源NLS和NES的引入对Clsp33的亚细胞定位具有明显的影响。同时,利用PVX载体对Clsp33进行了生物学功能分析,结果表明Clsp33对本氏烟具有致病性,推测其为潜在的毒力因子;Clsp33核定位信号序列五处酪氨酸K₅₂、K₆₃、K₆₄、K₇₁和K₇₂的同时突变影响了其对本氏烟的致病性,但单独突变或两两突变对其致病性影响不明显;而外源NLS和NES的引入对Clsp33的致病性具有明显的影响,推测Clsp33的致病性与其进核数量有一定的相关性。5、通过酵母双杂交对拟南芥的质粒文库进行初步筛选,发现Clsp33与PSR1-Interacting Protein 1（PINP1）有较强的互作。通过X-β-gel检测、ONPG法及BiFC证实了Clsp33蛋白与甜橙中同源蛋白CsPINP1间有较弱的互作,推测CsPINP1可能是Clsp33的潜在毒力靶标。