细胞微环境是细胞通过处理各种生物信号以及对环境产生影响来进行交流的局部环境。细胞膜微环境与细胞信号转导、黏附和增殖分化等生理过程密切相关,因此可视化分析细胞膜与其周围环境之间的相互作用有助于加深我们对相关生理和病理过程的理解和认识。常规的测定方法,包括流式细胞术,酶联免疫吸附测定,免疫染色和聚合酶链反应,通常需要在分析前逐步染色,洗涤等繁琐操作。替代方法包括化学探针或纳米颗粒在“静态”条件下测量标记物,因此难以实现动态方式实时监控细胞的行为。近年来,小分子荧光探针作为一种强大的分子工具在细胞膜成像相关领域取得了重大进展,但是它们通常存在水溶性差、容易内化到细胞质中以及荧光团局部积聚等缺点。总之,目前在高时空分辨率监测和追踪细胞膜表面生物分子方面,仍然存在重大挑战。核酸作为生物体的遗传物质,能够折叠形成多种二级结构,如双链体、茎环结构、三联体和G-四链体（G4）等。G4是由富含串联重复鸟嘌呤的DNA或RNA折叠形成的高级结构。四个鸟嘌呤通过Hoogsteen键形成环状平面,多个这样的平面结构通过金属离子螯合形成G4。基于这种特殊的拓扑结构,G4通过与不同类别靶标（主要包括酶,蛋白,小分子）结合,可以实现分子治疗、诊断和传感。其中,一些小分子G4探针与G4结合后,荧光显著增强,为生物成像与传感提供了新的分子工具。G4可通过商业化的DNA固相合成获得,并且具有优异的可设计性、亲水性和生物相容性等优点。小分子G4探针具有合成简便、结构改造容易的特点。本论文结合G4和小分子荧光探针的优势,构建基于G4/G4探针复合物的细胞膜传感器,以期解决当前细胞膜成像所遇到的难题。首先,受天然红色荧光蛋白（RFP）发光机制的启发,我们设计了一系列RFP生色团类似物,发现它们可以结合G4并发出红色荧光,首次实现了人工手段模拟RFP发光。该RFP模拟物具有优异的光学性质,并成功的应用于膜蛋白的活细胞和组织成像。其次,我们将SO₂衍生物和NO等信号分子的反应位点引入到苯并噻唑类G4探针的母核结构上,并结合功能化DNA构建了响应这些信号分子的比率型细胞膜传感器,实现了活细胞中SO₂衍生物和NO外排过程的原位监测。本文具体研究内容如下:（1）构建基于G4/小分子的RFP模拟物并探究其荧光特性。基于天然RFP生色团的母体结构,我们合成了6种RFP生色团类似物。它们自身荧光极其微弱,通过与G4封装,其荧光大幅增强,首次实现人工手段模拟RFP发光。RFP模拟物的最大荧光发射波长在583-668 nm,横跨红色和远红色光谱区域,与现有的RFP调色板完美匹配。与天然RFP相比,这些RFP模拟物（G4/RFP生色团类似物）具有高量子产率、大斯托克斯位移、优良的抗光漂白性和双光子荧光等优异的光物理化学性质。其中,基于DFHBFSI的RFP模拟物的量子产率高达0.39,斯托克斯位移为93 nm。此外,RFP生色团类似物作为一种特殊的G4探针,对平行G4拓扑结构有选择性,可用于平行、反平行和混合平行G4拓扑结构的区分。这项工作不仅为发展新型拓扑选择性G4探针指明了道路,也为发展新一代FP（荧光蛋白）模拟系统,包括红色,近红外和双光子荧光提供了全新的指导方案。（2）RFP模拟物的荧光发射机理研究及在细胞膜蛋白成像中的应用。密度泛函理论（DFT）计算表明RFP生色团类似物量子产率极低的原因是激发态的分子发生了扭曲的分子内电荷转移（TICT）。分子动力学（MD）模拟显示RFP生色团类似物与G4结合后,极大地限制了TICT诱导的生色团无辐射跃迁,从而实现荧光发射大幅增强。结合适配体（aptamer）对靶标分子的特异性识别,我们进一步将RFP模拟物用于细胞膜蛋白PTK7的生物成像。与荧光蛋白标签相比,RFP模拟物具有无需复杂遗传改造等优点。同时,RFP模拟物耐受光漂白,可以对活细胞膜蛋白进行长期实时监测。此外,RFP模拟物具有双光子特性,可用于深层组织成像的荧光成像,实验结果表明其组织穿透深度>80μm。基于RFP生色团类似物与功能性核酸结合构建的复合物,有望成为潜在的生物医学工具用于临床成像与诊断。（3）构建基于G4/响应性G4探针的比率型传感器。我们将具有反应活性的C=C双键引入苯并噻唑母核中构建了响应SO₂衍生物的G4探针1a,该分子能与SO₂衍生物发生迈克尔加成反应。1a及加成产物都不能发出荧光,因而单独1a无法用于荧光检测SO₂衍生物。当1a与G4结合形成1a-G4复合物后,在最大荧光发射波长（619 nm）处荧光增强了722倍。向复合物中加入HSO₃^-后,复合物的荧光在10 min内下降了87.6%,因此1a-G4复合物可用作SO₂衍生物的荧光探针。我们在G4末端标记一个荧光分子JOE作为供体,构建了一个选择性响应SO₂衍生物的FRET传感器,对HSO₃^-的检测限为0.45μM。采用类似的策略,我们合成了一个响应NO的G4探针2a,并构建相应的FRET传感器,实现了微摩尔浓度NO的分析。这种基于刺激响应性辅因子与功能化DNA相结合构建传感器的策略,极大的扩展DNA探针的有效应用范围。（4）模块化传感器在细胞膜微环境监测中的应用。在研究内容（3）的基础上,我们发展了模块化的细胞膜传感器,可以用于监测细胞膜微环境中信号分子的实时动态变化。该传感器由刺激响应性辅因子和功能化DNA这两个模块单元构成。其中功能化DNA模块提供刺激响应性辅因子结合的大π-平面结构支架、FRET供体以及插膜单元,刺激响应性辅因子模块提供信号识别单元。辅因子与信号分子反应后其荧光特性发生改变,同时引起传感器FRET信号变化。本文以胆固醇为插膜单元,分别将响应SO₂衍生物和NO的传感器固定到HepG2和Raw264.7细胞表面,实现了活细胞中SO₂衍生物和NO外排过程的原位监测。受益于模块化设计的优点,通过设计响应性辅因子并协调供体荧光团的光谱,可以构建响应多种信号分子的比率型细胞膜传感器。因此,本文发展的模块化策略综合了核酸分子和小分子探针的优点,为构建比率型细胞膜传感器提供了一个通用的方法。我们设想这个模块化传感器可能代表了“智能探针”设计的新策略,并为生物医学成像和临床诊断的多功能应用提供了潜在的强大工具。