研究目的婴幼儿的临床医疗中常需要使用全身麻醉药物,其安全性及对脑的发育和长期认知功能是否有不良影响,一直是专家学者以及患儿父母关注的问题。目前全麻药如何导致认知功能的损害或缺失目前仍未阐明清楚,并且缺乏其有效的临床干预手段。研究全麻药发育期神经毒性的发生机制,探寻有效的干预途径是目前研究的热点和重点之一,并具有重要的理论与实践意义。本课题拟利用异氟醚引起的发育期神经毒性模型,观察组胺H3受体激动剂RAMH对全麻药异氟醚发育期神经毒性的作用。以期明确:(1)RAMH预处理对异氟醚引起的新生大鼠海马区神经元凋亡的影响。(2)RAMH预处理对异氟醚引起的幼年大鼠记忆损害的影响。(3)异氟醚暴露后发育期大鼠海马p53表达及RAMH的影响。实验方法1.RAMH预处理对异氟醚引起的新生大鼠海马区神经元凋亡的影响用出生第6天新生SD大鼠,随机均分为3组。对照组4只,给予腹腔注射5%葡萄糖;模型组5只,正常造模,吸入1.6%的异氟醚持续6小时,复苏2小时;RAMH预处理组5只,先腹腔注射RAMH(0.1 mg/10g)后30分钟,然后造模,吸入1.6%的异氟醚6小时。造模时,吸入氧浓度为21%,输出气体总流量为1.5L/分钟,异氟醚浓度1.6%。每小时连续监测新生大鼠呼吸及皮肤色泽情况,等6小时异氟醚吸入麻醉完毕后,关闭异氟醚,继续吸入21%氧气,给予苏醒期2小时,待新生大鼠自然苏醒。造模完成后,灌注取脑,将脑组织放入4摄氏度多聚甲醛溶液浸泡,后固定24小时。然后按15%到30%的蔗糖浓度的梯度脱水,直至大脑组织沉底。接着以冠状位,包埋脑组织。放入-80摄氏度快速冷却。以冠状位行冰冻切片,切片厚度20um。而后进行免疫荧光染色,观察Caspase-3在各脑区的表达情况。2.RAMH预处理对异氟醚引起的幼年大鼠记忆损害的影响。用出生第6天新生SD大鼠,随机均分为4组。CON组7只,给予腹腔注射5%葡萄糖;ISO组7只,正常造模,吸入1.6%的异氟醚持续7小时,然后复苏2小时;RAMH组7只,腹腔注射RAMH(10 mg/kg)后,放回鼠笼;RAMH+ISO组7只,先腹腔注射RAMH(10 mg/kg)后30分钟,造模,吸入1.6%的异氟醚6小时。造模完成后,将新生SD大鼠统一放回鼠笼,直至第5周,进行Morris水迷宫实验。用分析软件分析大鼠的游泳路线、寻找平台潜伏期和新生大鼠在目标象限停留时间以及其距目标平台的平均距离,从而测试大鼠的空间学习和记忆能力。3.异氟醚暴露后发育期大鼠海马p53表达及RAMH的影响。用出生第6天新生SD大鼠,随机均分为3组。对照组5只,给予腹腔注射5%葡萄糖;模型组5只,正常造模,吸入1.6%的异氟醚持续6小时,复苏2小时;RAMH预处理组5只,先腹腔注射RAMH(10 mg/kg)后30分钟,然后造模,吸入1.6%的异氟醚6小时。造模时,吸入氧浓度为21%,输出气体总流量为1.5L/分钟,异氟醚浓度1.6%。每小时连续监测新生大鼠呼吸及皮肤色泽情况,等6小时异氟醚吸入麻醉完毕后,关闭异氟醚,继续吸入21%氧气,给予苏醒期2小时,待新生大鼠自然苏醒。造模完成后,迅速将新生大鼠断头,取出大脑,分离出双侧海马,用液氮快速冷冻后,置于-80摄氏度冰箱保存。然后提取目的蛋白,用BCA法测定样品的蛋白浓度,并使蛋白变性。然后制作Page凝胶,组装电泳槽进行蛋白电泳,使样品目的蛋白分开。然后通过转膜的方法把蛋白从Page凝胶转移至PVDF膜上,然后封闭,孵育一抗,二抗,最后显影。观察在RAMH预处理后异氟醚暴露下发育期大鼠海马p53的表达情况。结果1.新生第6天的SD大鼠,在异氟醚暴露6小时后,海马各区(包括CA1、CA3、DG区)Caspase-3信号表达显著增强,神经元凋亡明显,而给予组胺H3受体激动剂RAMH的新生大鼠相较于模型组海马各区Caspase 3信号表达减少,神经元凋亡得以改善。2.新生第6天的SD大鼠,在异氟醚暴露6小时后,饲养至出生第5周,ISO组幼年大鼠在第1、2、3、4天寻找平台潜伏期明显延长,且在目标象限停留时间明显减少,而距目标平台的平均距离明显增加。而RAMH+ISO组与ISO组相比,在第1、2天寻找平台潜伏期没有明显改变,而第3、4、5天寻找平台潜伏期明显减少,且在目标象限停留时间明显增长,而距目标平台的平均距离明显缩短。3.新生第6天的SD大鼠,在异氟醚暴露6小时后,ISO组新生大鼠海马区p53蛋白表达明显增多。而RAMH+ISO组与ISO组相比,发育期大鼠海马区p53蛋白表达明显减少。结论RAMH预处理抑制异氟醚引起的新生大鼠海马区(DG、CA1,CA3)神经元凋亡及记忆损害。RAMH抑制异氟醚引起的新生大鼠海马区p53上调可能是RAMH减轻异氟醚引起的发育期神经毒性的机制之一。