前言结直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一,居恶性肿瘤死亡原因的第二位,近年来发病率呈明显上升趋势。常规CT扫描具有良好的空间分辨率和密度分辨率,尤其是MSCT的应用,灵活运用多平面成像(MPR)可以较好的显示结直肠癌的肿瘤形态,可以判断对结直肠周围的侵犯情况及有否转移,但不能评价器官功能的改变。CT灌注成像的作用不同于常规CT扫描,可以评价器官、组织的血供情况及血流动力学的状态,并能对灌注过程做出定量及半定量的分析,由此反映肿瘤的恶性程度、预后及复发情况,从病变形态学的观察过度到微观的代谢和功能状态分析,在病变的诊断、临床分期及疗效的预测和评价方面均可发挥作用。随着多层螺旋CT的应用,使得灌注成像更快捷,时间分辨率更高,CT灌注技术已经被广泛运用于腹部脏器。侵袭、转移是恶性肿瘤最重要也是最本质的生物学特征,是恶性肿瘤患者死亡的主要原因,结直肠癌也不例外。恶性肿瘤的生长、转移和播散离不开自身血供的建立,这个过程的建立与血管生成因子(如血管内皮细胞生长因子,vascularendothelial growth factor,VEGF)释放增加及随之而来的微血管密度增加有关,而基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)可通过对细胞外基质降解,促进癌细胞对周围组织浸润和转移的发生,在肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用。本实验就结直肠癌CT灌注成像参数与MMP-2和VEGF表达情况及MVD计数相互间的相关性进行研究,从而为应用CT灌注成像预测结直肠癌侵袭转移能力提供依据。材料与方法1、临床资料2008年6月～2008年12月在中国医科大学附属第一医院就诊,临床诊断结直肠癌的61例患者行多层螺旋CT结直肠灌注成像。其中在检查后2周内经手术证实为结直肠癌,并且获取了肿瘤大体标本及完整病理报告的41例纳入本研究。男性30例,女性11例。年龄36～81岁,平均62.05±12.13岁。肿瘤位于直肠20例,直肠、乙状结肠交界处4例,乙状结肠4例,降结肠3例,横结肠3例,盲升结肠7例。41例均为腺癌,其中高分化4例,中分化34例,低分化3例。临床病理分期采用Dukes分期法,标准为:A期:癌肿侵犯粘膜或粘膜下层、浅肌层、深肌层;B期:侵犯浆膜层、浆膜外;C期:淋巴结转移;D期:远处转移或腹膜转移。本组41例中A期7例,B期19例,C期10例,D期5例。2、CT灌注扫描方法、图像后处理及分析(1)CT灌注扫描方法确认被检查者CT扫描前一周之内未做过消化道造影,检查前6小时禁食,确保肠道清洁。扫描前对患者进行呼吸训练,用腹带固定。检查前60～90min口服1%泛影葡胺500ml充盈消化道并嘱患者充盈膀胱,直肠内充气50～100ml。检查者仰卧于检查床上,先行腹盆部CT平扫。平扫后,选择病变最大层面做为靶层面进行灌注扫描。选用18G静脉留置针经肘前静脉注入造影剂欧乃派克(剂量50ml,注射速率6ml/s)后,延迟10秒后启动灌注扫描模式,持续时间50s,管电压120kv,管电流50mAs,层厚7～10mm,得到200幅图像。灌注扫描结束后,即刻经高压注射器继续注入50ml欧乃派克,速度3ml/s,再行腹部常规增强扫描,延迟时间分别为30s及70s,作为诊断图像。(2)CT灌注图像后处理及分析将CT灌注图像传送到Siemens图像后处理工作站,采用预装的Body Perfusion软件处理数据。西门子公司的CT灌注后处理软件采用的是非去卷积算法。经图像后处理获得病灶、靶动脉的时间密度曲线(time-density curve,TDC),通过TDC可计算出血流量(blood flow,BF)、血容量(blood volume,BV)、灌注起始时间(time to start,TTS)、灌注峰值时间(time to peak,TTP)、血管表面通透性(permeability surface,PS)和Patlak血容量(Patlak blood volume,PBV)等参数,同时得到BF、BV、TTS、TTP、PS、PBV伪彩图。ROI区域要选择明确的实性部分,多点采集取平均值。依结直肠癌病变水平高低的不同,流入动脉ROI取腹主动脉、髂外动脉(或股动脉)轴位图像的中心区域。3、病理标本处理及免疫组织化学方法病理学切片制备、染色及读片结果均在病理科老师指导下完成。(1)切片制作对所选病例的石蜡包埋组织行连续切片,切片厚4μ,连续切片4张,第一张切片行HE染色,其余3张用于免疫组化染色。(2)免疫组织化学实验方法免疫组织化学方法采用过氧化物酶标记的链霉素卵白素法(SP)染色。CD34、VEGF、MMP-2单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。已知的阳性结直肠癌切片作为阳性对照,阴性对照用PBS缓冲液代替一抗染色。(3)免疫组织化学结果判断微血管密度(microvascular density,MVD)计数:MVD定义为单位面积组织切片内CD34染色阳性的微血管细胞数。肿瘤内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表1条单独的微血管。先在低倍镜下(100×)浏览全片,找出微血管密度大的“热点”(hot spot),换高倍镜(200×),每张切片记录5个“热点”,取其平均数作为该病例的MVD。VEGF判定标准:以胞浆或胞膜呈均一棕黄色着色的细胞为阳性,无着色的细胞为阴性。判定标准参照Park等的方法:先用低倍镜(40×)全面观察切面,选定待测组织VEGF染色最强处,然后在200倍镜下计数100个细胞,阳性染色细胞＜5%为阴性(-);5～15%为弱阳性(+);16～50%为阳性(++);＞50%为强阳性(+++)。MMP-2判定标准:阳性主要表现为显微镜下肿瘤细胞胞质、血管内皮、间质中出现棕、黄色颗粒或团块。判定标准:先用低倍镜(40×)全面观察切面,选定待测组织MMP-2染色最强处,然后在200倍镜下计数100个细胞,阳性染色细胞＜5%为阴性(-);5～15%为弱阳性(+);16～50%为阳性(++);＞50%为强阳性(+++)。4、统计学处理所有数据用SPSS 13.0统计学软件包做分析处理。计量资料以均数±标准差表示,对于正态分布、方差齐性的计量资料,两组间比较采用t检验法或配对t检验法,多组间比较采用单因素方差分析的方法。对于偏态分布的计量资料或等级资料,采用非参数检验。参数间相关分析采用Person法或Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、本研究获得结直肠癌病灶、靶动脉的时间密度曲线,及一组完整的MIP图和彩色编码图包括BF、BV、TTS、TTP、PS、PBV图的资料和CT灌注参数值。MIP图可以观察肿瘤增强情况,类似于传统的增强扫描;而灌注图红色、黄色区域代表肿瘤内部血流灌注丰富的区域,绿色代表中度灌注区域,蓝色代表血流平乏的低灌注区域,因而彩色编码图可直接显示肿瘤内部的血流灌注状态(图1-8)。2、结直肠癌CT灌注参数的平均值41例结直肠癌的BF值为(65.65±27.37 ml/100ml/min),BV值为[85.11±37.14(1/1000)],TTS值为[26.91±13.98(1/10s)],TTP值为[97.70～288.50(1/10s)],PS值为[16.50～174.60(0.5ml/100ml/min)],PBV值为[17.10～291.10(1/1000)]。3、CT灌注参数值与MVD计数,VEGF和MMP-2表达间的相关性分析Person相关分析及Spearman秩相关分析表明:肿瘤实质区CT灌注参数BF、BV、PS与VEGF表达呈正相关(P＜0.05);肿瘤实质区CT灌注参数BF、BV、PS与MVD计数呈正相关(P＜0.05);MVD计数与VEGF表达亦呈正相关(P＜0.05);肿瘤实质区PS值与MMP-2表达呈正相关(P＜0.05)。结论1、BF、BV值在浆膜浸润组高于无浆膜浸润组,肝转移组的BF、BV值高于无肝转移组(P值＜0.05)。PS值在浆膜浸润、肝转移、淋巴结转移各组中均高于无浆膜浸润、无肝转移、无淋巴结转移组(P值＜0.05)。2、CT灌注成像某些参数可以反映血流灌注特点,这为进一步研究肿瘤微血管,找出肿瘤灌注参数与免疫组化指标间VEGF、MMP-2间的相关性,评价肿瘤侵袭转移能力奠定基础。3、肿瘤实质区CT灌注参数BF、BV和PS值与VEGF表达呈正相关,肿瘤实质区CT灌注参数BF、BV和PS与MVD表达呈正相关,MVD表达与VEGF表达亦呈正相关。CT灌注成像参数PS与MMP-2的表达显著相关。4、CT灌注参数不仅能反映结直肠癌微血管生成情况的MVD,而且可反映VEGF和MMP-2表达情况,表明CT灌注参数BF、BV和PS可作为一种活体评价肿瘤微血管生成和侵袭转移能力的指标。