放射性肺损伤是胸部肿瘤患者放射治疗过程中的常见并发症,不仅大大降低放疗效果,而且严重影响患者的生活质量。二甲双胍是临床二型糖尿病的一线治疗药物,具有良好的生物安全性。除降糖作用外,近年的研究还发现其在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫功能等方面均有一定功效。另外,二甲双胍在逆转纤维化方面也有一定作用,但在放射性肺损伤中相对研究较少,且作用的具体机制尚不清楚。目的及意义本研究采用X射线单次全胸照射小鼠,建立放射性肺损伤动物模型,并从血清学、组织学、分子机制研究、肠道微生物等多角度对所采集的数据进行整合分析,旨在阐明二甲双胍对放射性肺损伤的防护作用及其作用机制,找出主要影响通路和作用靶点,为临床放射性肺损伤防治提供理论指导。方法:6-8周龄雄性C57BL/6 J小鼠适应性喂养一周,按体重随机分为四组:健康对照组（Control）、单纯照射组（15 Gy）、低剂量二甲双胍联合照射组（L-MET+15 Gy,100 mg/kg）及高剂量二甲双胍联合照射组（H-MET+15 Gy,200 mg/kg）。二甲双胍组于照射前三天始在饮水中干预,照射采用德国西门子6 MV高能X射线单次全胸照射,总剂量为15 Gy,剂量率为300 cGy/min,源皮距为100 cm,照射野为2 cm×40 cm。二甲双胍组照后继续给予干预,直至实验结束。期间观察小鼠的精神状态、摄食、饮水、体重、毛发等一般生命体征的变化。第一部分 研究二甲双胍对早期放射性肺炎的防护作用及其机制。于照后3.5天和14天,处死小鼠,每组5只,取血检测血常规和血清炎症因子;取肺,左肺用福尔马林固定,观察肺组织病理学及炎症相关因子表达,右肺于-80℃保存,用于分子机制研究.第二部分 研究二甲双胍对晚期放射性肺纤维化的防护作用及机制。于照后6个月,处死小鼠,每组12只,样本采集方法同前,收集肺泡灌洗液（Broncho alveolar Lavage Fluid,BALF）、血清、肺组织及肠内容物,用于炎症因子测定、病理组织学分析、分子机制研究和肠道菌群检测。结果:第一部分 二甲双胍对早期放射性肺炎的防护作用及其作用机制1.照射后3.5天和14天,与Control组相比,15 Gy照射组小鼠摄食量和饮水量于照后1天开始减少,并伴随体重减轻,精神不佳,照后3天达到最低值,此后又慢慢回复,二甲双胍干预组,上述现象有一定程度缓解,且高剂量组效果更好。2.15 Gy照射组小鼠的胸腺指数显著降低,肺湿重和肺湿重/体重比（LWW/BW）显著增加,与Control组比,具有显著的统计学意义（P＜0.05）;二甲双胍干预能够降低肺湿重和LWW/BW,与15 Gy照射组比,高剂量二甲双胍干预效果更佳（P＜0.05）。3.肺病理组织学结果显示:Control组小鼠肺组织及肺泡形态结构完好、清晰,无任何病理性改变,照后3.5天,15 Gy照射组小鼠肺组织内可见肺间隔增厚、肺间质充血水肿,肺泡腔变小,内见少量的炎性渗出物,并伴有少量的炎症细胞浸润,而L-MET+15 Gy组和H-MET+15 Gy组显著改善了肺损伤,病理评分分别下降50.00%和58.33%（P＜0.05）。照后14天,15 Gy照射组小鼠肺充血更加明显,肺间质进一步增厚,肺泡腔较3.5天进一步变小,内见大量的炎性渗出物,并伴有大量炎症细胞浸润,而二甲双胍干预上述现象明显减轻,病理评分分别下降了45.45%和 54.54%（P＜0.05）。4.照射后的血清炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平显著上升,与对照组比,具有显著统计学意义（P＜0.05）。二甲双胍干预能够降低炎症因子的水平,特别是IL-6和TNF-α的水平,与15 Gy照射组比,具有显著统计学意义（P＜0.05）。肺组织HMGB1和NF-κB免疫组化和Western Blot结果表明,与Control组比,照射后细胞阳性染色率和蛋白表达量均有明显增加,而二甲双胍干预能够降低其表达,与15 Gy照射组比,具有显著统计学意义（P＜0.05）。第二部分 二甲双胍对放射性肺纤维化的防护作用及其作用机制1.照后6个月小鼠一般生命体征:与Control组相比,小鼠在照后第二天便出现精神不振,摄食和饮水量下降,伴有体重减轻,3天达到最低,此后又慢慢回复。照射组小鼠胸部毛色在照后3个月便开始出现白化和脱毛现象,二甲双胍干预组出现较15 Gy照射组晚,且白化和脱毛现象轻。2.肺湿重及LWW/BW值的数据显示,照射组数值明显增加,与Control组相比（P＜0.01）;与15 Gy照射组比,二甲双胍干预后数值显著回落（P＜0.01）,且高剂量二甲双胍干预的效果更佳。3.肺组织的HE结果显示:Control组小鼠肺组织结构清晰、肺泡及肺泡间隔均正常,未见任何病理性改变;15 Gy照射组小鼠肺组织纹理结构紊乱,有的部位可见条索状改变,肺泡壁明显增厚,肺泡腔缩小,腔内的纤维组织团与泡壁融合,肺间质明显增宽,间质部分可见肌成纤维细胞大量增生,细支气管及血管周围被纤维组织包绕,同时伴有不同程度的炎性细胞浸润等。而L-MET+15 Gy组和H-MET+15 Gy组均能改善肺的这些病理性改变,且H-MET+15 Gy组的效果更加明显。Control组、15 Gy组、L-MET+15 Gy组和H-MET+15 Gy组的肺组织病理评分分别为 0.40±0.55、2.20±0.45、1.40±0.55、1.00±0.71,组间比较有显著的统计学意义（P＜0.05）。Masson染色结果显示:15 Gy照射组小鼠的肺组织中胶原含量显著升高,而L-MET+15 Gy组和H-MET+15 Gy组中胶原含量明显降低,且呈剂量依赖性,高剂量二甲双胍干预效果更佳。对Masson染色结果进行半定量分析,Control组、15 Gy组、L-MET+15 Gy组和H-MET+15 Gy组的分值分别为 1.00±0.71、6.40±1.14、4.20±0.84、3.00±1.00,组间比较有显著的统计学意义（P＜0.01）。肺组织免疫组化和Western blot结果显示,照射组小鼠肺组织纤维化相关因子Collagen-I、TGF-β1和Samd2含量显著升高,二甲双胍干预能够降低其表达。4.肺组织、血清和BALF炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的结果显示,照射后均有明显升高,二甲双胍干预能够不同程度降低这些炎症因子的表达水平。5.HMGB1作为重要的炎症调控因子,免疫组化和ELISA结果显示,15 Gy照射组HMGB1水平显著上升。Western blot的结果显示,与Control组比,15 Gy照射组中TLR4、IKKβ、NF-κB、MyD88、HMGB1和IL-1β的蛋白表达水平均明显升高,具有统计学意义。不同剂量二甲双胍干预后这些蛋白的表达不同程度的降低,且高剂量二甲双胍组干预效果更为明显（P＜0.05）。6.此外,照射后肺组织SOD和GSH水平显著下降。为了了解铁死亡在二甲双胍防治肺纤维化中的作用,进一步检测了肺组织中铁死亡相关的ACSL4、SLC7A11、Gpx4的蛋白表达。结果发现:15 Gy照射组小鼠肺组织中铁死亡脂质过氧化的核心蛋白酶ACSL4蛋白表达显著上升,二甲双胍干预能够降低其表达,且高剂量组下调效果更加明显（P＜0.05）。SLC7A11和Gpx4蛋白表达在15 Gy照射组中出现了明显下降,二甲双胍干预能够提高其表达量（P＜0.05）。7.肠道菌群的16SrDNA高通量测序结果表明,四组小鼠在属水平上肠道细菌结构存在显著差异。主成分分析显示Control组和15 Gy照射组菌群结构分开较好,提示两组微生物组成结构差异较大。进一步分析发现,在属水平上15 Gy照射组乳杆菌和毛螺菌科细菌相对丰度显著降低,而二甲双胍干预能够提高其丰度,特别在高剂量二甲双胍组能够显著提高,与15 Gy组比,具有显著统计学意义（P＜0.05）。结论:1.二甲双胍对早期放射性肺炎和晚期放射性纤维化均具有防护作用;2.二甲双胍可抑制辐射引起的炎症因子和促炎介质的释放、降低促纤维化诱导因子的表达,进而改善放射性肺损伤;3.调节HMGB1/TLR4信号通路和铁死亡可能是二甲双胍防治放射性肺损伤的重要靶点;改善辐射所引起的肠道菌群紊乱可能是二甲双胍改善放射性肺损伤的又一途径。