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本研究是以罗曼鸡9~10期胚胎生殖新月区、12~17期胚胎血液为试验材料,分别制备了生殖新月区的组织切片和胚胎血液涂片,用PAS染色法鉴别、计数及分析原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)形态结构特征。同时,分别采用EDTA-胰酶酶解法和Ficoll密度梯度离心法分别提取生殖新月区及血液中的PGCs,并且将分离的PGCs在不同条件下分别进行体外培养,以探索有效的PGCs培养条件,为今后制作生殖腺嵌合体及转基因禽类的研究奠定基础。试验结果如下:
1.PGCs的形态生殖新月区的PGCs呈不规整的圆形或卵圆形,细胞内含有大量的糖原颗粒,细胞直径为20±1.8μm,核的大小为7.9±1.5μm。血液中PGCs呈规整的圆形,糖原颗粒减少直径为17.2±2.1μm,核的大小为7.0±1.1μm。
2.PGCs的分离及纯化经分离纯化,在每个生殖新月中平均获得107.1±8.9个PGCs。在12~17期胚胎中,13和14期胚胎血液中PGCs数目最多,分别为37.8±3.7个/μl和40.8±4.7个/μl,浓度分别为0.01028%和0.00816%,至17期大部分PGCs进入原始生殖嵴,血液中的数量减为3.0±1.1个/μl,证明14期应为采集PGCs最佳时期。将13~14期胚胎血液采用Ficoll密度梯度离心法进行纯化,分离效果为94.5±1.2%,纯度为27.7±1.7%。
3.PGCs体外培养研究将分离的13~14期鸡胚血液中PGCs在不同饲养条件下培养,当在无饲养层的M199基础培养基中培养,PGCs可存活2~d天。培养期间细胞生存率直线下降,第3天时细胞存活率降至14.6±6.8%,至第4d时细胞存活率不足1%。当PGCs在鸡成纤维细胞饲养层上培养并添加有bFGF时,生存时间延长,第3d和第5d存活率分别为59.9±9.8%、32.3±7.6%,并表现出较弱的增殖能力。