第一部分兔抗猪内源性逆转录病毒P15E多克隆抗体的制备研究背景和目的猪器官、组织和细胞作为临床移植的供体源具有广泛和良好的应用前景,可缓解临床器官移植的器官相对短缺；也可为临床治疗1型胰岛素依赖型糖尿病,帕金森病、亨廷顿病和癫痛病等顽固性神经疾患提供一种治疗方法。猪肝细胞也可作为猪肝细胞型生物人工肝的生物成分治疗急性爆发性肝炎肝功能衰竭和终末期肝功能衰竭的过渡性措施。自Dr.Clivepatienee(BioTransplantxnc首席科学家)1997年报道猪内源性逆转求病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)感染体外培养人源细胞以来,猪异种移植或猪肝细胞型生物人工肝治疗过程中可能发生PERV种间传播的潜在危险引起众多学者的广泛关注。Patience等首先证实至少有三种PERV亚型在体外培养能够感染人源细胞,Takeuchi和Martin等也证实PERV i可以感染体外培养的人源细胞株。1998年,Denner J等报道逆转录病毒的一个结构蛋白即跨膜蛋白P15E是一个活性成分,在体内和体外可以抵制免疫反应；P15E的检测可以作为检测PERV表达及其是否具有感染性的一个诊断指标。国内及国际抗体市场上并未见应用于检测PERV P15E的特异性抗体,本研究在国外报道的PERV P15E抗原位点的基础上,设计并制作了兔抗猪PERV P15E多克隆抗体,该抗体用于检测PERV P15E在蛋白方面的表达水平具有很高的灵敏度及特异笥。该抗体的研发,对检测临床器官移植和猪肝细胞型生物人工肝中PERV的表达和传播具有重要意义。方法根据文献报告获得了PERV P15E抗原表位E1和E2蛋白序列,再根据其蛋白序列反推获得了P15E E1和E2的核酸序列。P15E核酸序列最小长序317bp,为增强其抗原性以及表位的完整性,我们将P15E前方100bp核酸序列一起扩增,通过PCR扩增方法扩增得到了P15E编码区序列,然后将其连接到PGEX-4T-1载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,再通过自身诱导法诱导表达重组质粒的融合蛋白通过割胶回收纯化融合蛋白。免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot不ELISA检测抗体活性和滴度。结果兔抗猪PERV P15E多克隆抗体可以特异性检测P15E抗原蛋白以及猪肾细胞系PK15中P15E蛋白的表达,而人肾细胞系HEK293中则检测不到该蛋白表达,证实本抗体特异性强。ELISA检测兔抗猪PERV P15E多克隆抗体滴度效价达到了1：100.000。结论本研究所获得的兔抗猪PERV P15E多克隆抗体不仅效价高,而且特异性强,可以作为检测临床器官移植和猪肝细胞型生物人工肝中PERV表达和传播的重要工具。第二部分逆转录病毒介导的RNA干扰抑制西藏小型猪成纤维细胞中PERV表达的研究研究背景和目的异种移植在治疗人类疾病方面提供了极为丰富的器官、组织和细胞来源。因为猪来源方便,易于繁育,与人体解剖和生理有很高的相似性,可选择合适大小的器官和丰富且功能良好肝细胞,成为了异种移植和生物人工肝的首选。然而,对于异种移植和生物人工肝而言,作为异种来源的猪器官、组织和细胞,其内存在猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV), PERV是一种γ逆转录病毒,它整合于猪的染色体中:根据猪种的不同,其PERV拷贝数和mRNA的表达量也有很大差异。目前用于抵制PERV表达的猪成纤维细胞均来源于具有高PERVmRNA表达背景的德国大白猪,经RNA干扰技术进行基因沉默后,虽然其表达量下降,但是由于RNA干扰技术存在“脱靶效应”,所以这种具有PERV mRNA高表达背景的核供体细胞在一定程度上仍然具有较高的潜在感染风险。为了获得一个极低量PERV表达的猪成纤维细胞,为下一步建立转基因猪提供安全的核供体细胞。本研究选用具有PERV mRNA低表达的中国西藏小型猪成纤维细胞,同时利用RNA干扰技术,获得了稳定表达shRNA且具有PERV极低量表达的猪成纤维细胞,为下一步建立转基因猪提供了更为安全的核供体细胞。方法针对高度保守的PERV-gag和PERV-pol区域,设计siRNA并构建于pSUPERretro-GFP/Neo表达载体后转染PERV-HEK293细胞,并利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot和细胞免疫化学检测PERV表变化,筛选获得最有效的shRNA片段通过逆转录病毒表达载体导入西藏小型猪成纤维细胞中,并进行抗性筛选;最后在利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot(?)细胞免疫化学检测阳性克隆西藏小型猪成纤维细胞中PERV表达量。数据处理：所得实验数据用均数±标准差(x±SD)表示,取检验性显著水准a=0.05,用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,对实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析、样本方差齐性时选用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时则选用Tamhane’s T2法进行比较以及独立样本t检验进行两样本均数的比较。结果建立了表达PERV的PERV-HEK293细胞模型,该细胞模型不仅在mRNA水平表达PERV,而且在基因组也整合有PERV基因shRNA转染PERV-HEK293细胞后,利用SPSS13.0软件对其实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析显示：shRNA转染影响PERV-HEK293细胞中PERV表达(F=583.823,P<0.001),组间多重比较(Tamhane’sT2法)显示：shRNA-pol3转染PERV-HEK293细胞后PERVmRNA相对表达量为(16.733±0.961)%与阴性对照组(91.467±6.312)%,相比具有显著差异性(P<0.001)；PERV-HEK293细胞中PERV蛋白表达也显著下降；shRNA-pol3经逆转录病毒载体导入西藏小型猪成纤维细胞后,表现出较高的干扰效率,两样本独立t检验分析显示：干扰后的西藏小型猪成纤维细胞与未干扰的西藏小型猪成纤维细胞相比具有显著差异性(t=27.032,P<0.001),其PERV P15E蛋白表达也显著下降。结论稳定表达shRNA的西藏小型猪成纤维细胞具有了较前更低的PERV表达量,为我们下一步培育稳定表达shRNA的转基因猪提供了更为安全核供体细胞。第三部分多重RNA干扰技术抑制中国实验用小型猪成纤维细胞中PERV表达的研究研究背景和目的猪细胞和组织中存在有猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)。体外培养实验和感染性实验已经证实PERV可以感染人源细胞。Van der Laan等将猪胰岛细胞移植于非肥胖性糖尿病SCID鼠腹腔中,并检测鼠组织PERV mRNA的表达,结果发现多种组织发生PERV感染,这是移植猪组织后种间交叉感染、体内PERV主动复制的首次报道。为了最大程度地抑制PERV表达和传播的可能性,人们采用了不同策略,如前面第二部分所提及利用RNAF扰技术去抑制PERV mRNA和蛋白表达,是目前抑制PERV表达的首选方法；目前学者多通过病毒载体将siRNA导入猪成纤维细胞中进行干扰,达到siRNA在细胞中稳定表达,如Dieckhoff等利用慢病毒载体将siRNA导入猪成纤维细胞中对PERV进行干扰：我们在前期也利用逆转录病毒载体将siRNA导入细胞中进行PERV干扰,然而,我们在干扰PERV表达的同时又将携带siRNA的病毒载体导入了细胞,从而引起了另一种安全隐患。慢病毒载体被认为是目前转染效率最高的载体,广泛应用于基因治疗、细胞工程等领域。但由于慢病毒载体整合位点的不确定性,可能会导致插入突变甚至激活原癌基因。Howe SJ等报道了在接受慢病毒介导基因治疗的10名SCID-X1患者,因携慢病毒载体将调控序列和正常基因整合在LMO-2基因上游35kb处,导致LMO-2过表达造成急性T淋巴细胞性白血病。尽管研究者已通过多种方法来提高慢病毒载体的安全性,如改变LTR序列、采用灭活病毒、分离结构蛋白基因与包装基因等,但是仍不能完全排除致瘤的可能性。Nyberg, S.L等曾报道过生物人工肝治疗过程中,治疗用细胞进入患者体内。细胞的变形运动、治疗过程中滤过膜破损都可能导致永生化细胞进入患者体内,永生化细胞裂解后释放出基因片段也可能进入患者血浆中。可见在进行细胞基因修饰的过程中,病毒载体的利用带来了极大的安全隐患。为了达到不使用病毒载体又可以稳定高效的抑制PERV之达的目的,我们利用了Perv-silencer表达载体,该载体具有4个不同哺乳动物启动子(hU6、hH1、mU6和h7SK),4个启动子分别操纵的shRNA转录结构单元(启动子-shRNA(?)义链—loop环-shRNA反义链—终止信号),不同启动子转录各自相应的shRNA结构单元,有效避免意外重组,而且每条shRNA能够有效转录。实现了一个载体编码4条shRNA,可以起到了对PERV-gag不PERV-pol区域的多重干扰。此外,在猪成纤维细胞的选择上,我们在前期研究的基础上选取具有PERV mRNA(?)表达且不含PERV-C的中国实验用小型猪成纤维细胞；针对PERV-gag和-pol的高度保守区域,设计并筛选到了4个干扰效率最高siRNAs片段,将其构建于同一表达载体后,利用电穿孔技术将其导入中国实验用小型猪成纤维细胞中,通过抗性筛选,进而获得可以稳定抑制PERV表达的猪成纤维细胞,为下一步建立转基因猪提供了更为安全的核供体细胞。方法在本研究中,我们针对PERV高度保守的gag和pol区域,设计了8个small interfering RNA (siRNA)片段,将8个siRNA片段直接转染PK15细胞,进行PERV干扰,利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot筛选出了能够抑制PERV表达最有效的4个siRNA片段,将这4个siRNA片段构建于同一载体perv-Silencer中,通过电穿孔技术导入PK15细胞进行多重干扰的初步验证,利用实时荧光定量RT-PCR和细胞免疫荧光验证PERV表达变化；经前面筛选和验证后,将重组表达载体通过电穿孔技术稳定转染到了中国实验用小型猪成纤维细胞中进行多重siRNA干扰,利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测其PERV表达量。将获得的经基因修饰后的中国实验用小型猪成纤维细胞培养上清与HEK293细胞共培养,并通过RT-PCR检测共培养后的HEK293细胞中PERV表达。数据处理：所得实验数据用均数±标准差(x±SD)表示,取检验性显著水准a=0.05,用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,对实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析、样本方差齐性时选用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时则选用Tamhane’s T2法进行比较。结果利用SPSS13.0软件对其实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析显示:siRNA直接转染影响PK15细胞中PERV表达(F=690.784,P<0.001),组间多重比较(Tamhane’s T2法)显示：siRNA-pol2, siRNA-po13, siRNA-gagl和siRNA-gag4转染PK15细胞后PERVmRNA相对表达量分别为：(17.967±0.779)%,(17.917±1.094)%,(16.067±1.041)%,(18.100±0.832)%,与阴性对照组(98.317±1.074)%,相比具有显著差异性(P<0.001)；其相对应的PERV P15E蛋白水平也显著下降；重组Perv-silencer表达载体转染PK15细胞后,对PK15细胞中PERV的表达具有很好的干扰效果,实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析显示：重组Perv-silencer表达载体转染影响PK15细胞中PERV表达(F=25615.576,P<0.001),组间多重比较(LSD法)显示：重组Perv-silencer表达载体转染PK15细胞后PERV-gag和PERV-pol mRNA相对表达量分别为：(10.317±0.591)%和(9.733±0.568)%,与阴性对照组(98.317±1.074)%,相比具有显著差异性(P<0.001)；免疫荧光检测其P15E蛋白表达也显著下降；重组Perv-silencer表达载体稳定转染中国实验用小型猪成纤维细胞后,实时荧光定量RT-PCR结果进行单因素方差分析显示：重组Perv-silencer表达载体稳定转染影响中国实验用小型猪成纤维细胞中PERV表达(F=5131.238,P<0.001),组间多重比较(Tamhane’sT2法)显示：重组Perv-silencer表达载体转染中国实验用小型猪成纤维细胞后PERV-gag和PERV-pol mRNA相对表达量分别为：(7.100±1.037)%和(7.650±1.118)%,与阴性对照组(96.112±2.623)%,相比具有显著差异性(P<0.001)；Western blot和免疫荧光检测其P15E蛋白显著下降；基因修饰后的中国实验用小型猪成纤维细胞培养上清液与HEK293细胞共培养结果显示HEK293细胞未感染PERV。结论本实难获得的稳定表达siRNA的中国实验用小型猪成纤维细胞具有极低量的PERV表达,且没有PERV-A/C感染的风险；由于本实验中未使用病毒载体,所以也避免了病毒载体进入细胞中所引起的安全隐患,可以作为下一步培育更为安全的转基因猪的核供体细胞。