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骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins-2)和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic proteins-4)属转化生长因子超家族(TGF-β)重要成员,是动物机体生长发育过程中的必需因子,其生物学作用几乎涉及全身所有系统,尤其是在诱导动物骨组织形成及生长方面具有重要的调控作用。鉴于BMP2和BMP4基因具有如此重要的功能,本研究将BMP2和BMP4基因作为影响黔北麻羊生长性状的候选基因,从分子遗传角度,通过直接测序技术检测黔北麻羊BMP2和BMP4基因的多态性,并筛选出与黔北麻羊生长性状显著相关的位点。从表观遗传学角度,运用亚硫酸氢盐处理后测序(BSP)技术探究BMP2和BMP4基因启动子区Cp G岛的甲基化状态,并与荧光定量PCR检测到的m RNA表达量进行相关分析,以明确甲基化程度与基因表达水平间的关系。从细胞分子生物学角度,构建BMP2、BMP4基因真核表达载体,并转染黔北麻羊成肌细胞,MTT法检测过表达后细胞的增殖情况,为阐释BMP2和BMP4基因对骨骼肌生长发育的生物学作用及机制提供理论参考。主要研究结果如下:1、BMP2和BMP4基因的多态性及其对黔北麻羊生长性状的影响利用直接测序法检测200只4～6月龄黔北麻羊(公、母羊各100只)BMP2和BMP4基因的SNPs位点,其中BMP2基因共筛选出3个SNPs位点,分别为g.48698728 T>C,g.48700188 G>A和g.48700206 G>A(位于内含子2);BMP4基因共筛选出5个SNPs位点,分别为g.33676037 T>C和g.36676044 G>A(位于启动子区),g.36679942 G>A和g.36680005 G>T(位于内含子1),g.36681702T>C(位于内含子2)。根据测序结果,各突变位点均存在三种基因型,遗传特性分析表明,各突变位点均属于中度多态性(0.25C和g.48700206G>A突变位点的基因型分布未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),g.48700188G>A突变位点的基因型分布极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.01);在BMP4基因5个SNPs位点中,各SNPs位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。单倍型和连锁不平衡分析表明,BMP2基因3个SNPs位点在群体中存在5种单倍型,其中有3种发生频率最高,g.48700188G>A和g.48700206G>A位点存在强连锁不平衡效应;BMP4基因5个SNPs位点在群体中存在10种单倍型,其中有4种发生频率最高,g.33676037T>C和g.36681702T>C、g.36676044G>A和g.36679942G>A、g.36676044G>A和g.36680005G>T、g.36676044G>A和g.36681702T>C、g.36679942G>A和g.36680005G>T、g.36679942G>A和g.36681702T>C位点间存在强连锁不平衡效应。关联性分析结果表明,BMP2和BMP4基因的多态性与多个生长性状存在显著差异(P<0.05)。因此,有望将这些SNPs作为候选分子遗传标记进一步研究。2、黔北麻羊BMP2、BMP4基因组织表达谱分析实时荧光定量PCR结果显示,BMP2、BMP4基因在黔北麻羊各组织中广泛表达,在肺脏组织中的表达量差异极显著(P<0.01)。其中,BMP2基因表达量的依次为:肺脏>下丘脑>脂肪>肌肉>肾脏>小肠>胸腺>肝脏>胃脏>心脏>脾脏;BMP4基因表达量的依次为:肺脏>肌肉>肾脏>下丘脑>脂肪>下丘脑>小肠>心脏>胃脏>脾脏>胸腺>肝脏。除胃外,BMP2、BMP4基因在6月龄黔北麻羊各组织中的表达量显著高于1.5周岁黔北麻羊各组织中的表达量(P<0.05)。3、BMP2、BMP4基因启动子区Cp G岛甲基化水平与m RNA表达的关系利用亚硫酸氢盐处理后测序(BSP)技术,对不同生长发育阶段黔北麻羊肺脏、肌肉、脂肪组织中BMP2、BMP4基因启动子区Cp G岛的甲基化状态进行探究。结果表明,BMP2、BMP4基因在肺脏、肌肉、脂肪组织中甲基化水平相对较低,3种组织的甲基化程度存在差异。在不同生长发育阶段,6月龄黔北麻羊肺脏、肌肉中的甲基化水平显著低于1.5周岁黔北麻羊肺脏、肌肉中的甲基化水平(P<0.05)。BMP2、BMP4基因甲基化程度与m RNA表达量相关分析显示,二者之间呈负相关趋势。4、BMP2、BMP4基因过表达对成肌细胞增殖分化的影响利用同源重组法构建BMP2、BMP4基因过表达载体p EGFP-N3-BMP2和p EGFP-N3-BMP4,成功转染已鉴定的黔北麻羊成肌细胞,q RT-PCR检测过表达后BMP2、BMP4基因及分化标志基因Myo D、Myf5、Myf6基因的m RNA表达量,结果显示,与对照组(p EGFP-N3空载体)相比,实验组(过表达载体)BMP2和BMP4基因的表达水平极显著上升(P<0.01),分化标志基因Myo D、Myf5、Myf6基因的表达水平显著提高(P<0.05)。MTT法检测过表达与未过表达BMP2、BMP4基因细胞的增殖情况,发现过表达BMP2、BMP4基因对细胞的增殖具有一定的促进作用。