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布鲁氏菌（Brucella spp.）是兼性胞内寄生菌,是布鲁氏菌病的病原。布鲁氏菌病是世界范围内新兴的动物传染病。布鲁氏菌具有独特的调控宿主免疫系统的机制,具有感染巨噬细胞的能力。自然宿主如绵羊、山羊和牛感染布鲁氏菌后会影响生殖系统,导致流产和不育;人感染布鲁氏菌后会虚弱、发热,主要特征为波浪热。在低收入国家中,羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌是最常见的三种布鲁氏菌,它们导致经济损失,危害动物健康和公共安全。在慢性感染时,布鲁氏菌感染网状内皮细胞,控制胞内运输,在巨噬细胞内寄生。在巨噬细胞中,布鲁氏菌面对着严酷的环境,如营养缺乏、氧化、酸化、渗透压的变化和热变化。布鲁氏菌采用多种策略应对不断变化的环境,如转录后调控基因的表达。小分子非编码RNA（sRNAs）在细菌基因表达中扮演重要角色,是细菌中关键的调节因子。通常情况下,sRNA的长度为50-200 nt,由基因间区域编码,作用于与其相互独立的靶基因。在模式细菌如沙门氏菌和大肠杆菌中,已经发现并实验验证了超过200条sRNAs,而在布鲁氏菌中,目前只发现并研究了5条sRNAs。在本研究中,我们使用生物信息学和实验研究了sRNA AbcR1与其靶基因mRNAs的互作。我们从羊种布鲁氏菌的转录因子和双组分调控因子中选择了7个靶基因。基于大肠杆菌的双质粒superfolderGFP报告系统表明AbcR1调控靶基因mRNAs,以实现sRNA的调控功能。靶基因BMEI0513、BMEI1615、BMEII0390、BMEI1751和MEII0853的mRNAs在AbcR1的调控下表达了更强的荧光,表明AbcR1上调了靶基因mRNAs的表达水平。在sRNA AbcR1的调控下,BMEII1022表达了中等强度的荧光,而BMEI0387表达了较弱的荧光,这表明AbcR1下调了靶基因mRNAs的表达水平。通过Western blot和qRT-PCR的验证,我们进一步证明了sRNA AbcR1与靶基因mRNAs的互作,其结果也表现出显著的上调或下调。然后,我们构建了sRNA AbcR1突变株,在突变的sRNA AbcR1调控下,靶基因mRNAs表现出显著的上调或下调。通过靶基因种子序列的点突变,我们还构建了靶基因突变体。种子序列突变后,靶基因mRNAs的表达水平显著上调或下调,这表明种子序列的配对对于AbcR1和靶基因mRNAs来说至关重要。为了更深入地研究,我们构建了穿梭质粒pZF17-08,在布鲁氏菌中证实sRNA-mRNA互作。穿梭质粒p ZF17-08能够在布鲁氏菌中稳定复制,并可以作为验证sRNA-mRNA互作的平台。分别以羊种布鲁氏菌16M基因组DNA、pBBR1MCS-5质粒和p ZF17-08质粒为模板,PCR扩增3个片段,并使用in-fusion法克隆至pMD18-T载体中,作为参照质粒。质粒溶解曲线分析表明,模板pZF17-08、pBBR1MCS-5和羊种布鲁氏菌的Tm值分别是85.62±0.18°C、85.29±0.22°C和85.89±0.15°C。标准曲线的斜率分别是-3.4154、-3.4112和-3.4278。R2值分别是0.9999、0.9997和0.9985。将pZF17-08质粒的拷贝数设为1,扩增效率E值分别是96.242、96.405和95.983,表明这三者的扩增效率几乎一样。我们将靶基因mRNAs分别克隆至pZF17-08质粒,进一步构建了点突变的靶基因mRNAs,突变位点位于种子序列内。将细菌培养物接种于微量滴定板中检测荧光值,靶基因mRNAs表现出显著的上调或下调。此外,我们使用Western blot证实了sRNA-mRNA互作,并利用qRT-PCR验证了靶基因mRNAs的表达水平。与突变型相比,野生型靶基因mRNAs表现出显著的上调或下调。综上所述,我们的研究表明sRNA AbcR1含有保守的种子序列,能够与靶基因mRNA互作。这些靶基因都是转录因子或双组分系统调控因子,对布鲁氏菌具有重要的调控意义。通过与种子序列互作,AbcR1保守区域可以调控多个靶基因mRNAs。此外,我们建立了在布鲁氏菌中验证sRNA-mRNA互作的平台。AbcR1的保守性及其对转录因子和双组分系统因子的调控突出了羊种布鲁氏菌sRNA AbcR1的重要作用,也对我们理解细菌致病性和未来研发治疗布鲁氏菌病的新型有效的药物具有重要意义。