研究背景：肝纤维化是一种肝内慢性损伤修复反应，是在各种致病因子（如炎症、损伤、药物、遗传因素等）作用下，肝内纤维组织异常增生，细胞外基质（extracellular matrix,ECM）弥漫性大量产生和沉积，合成和降解失衡，继发肝脏自我修复的动态可逆性病理过程。肝纤维化损害肝组织的结构和功能，其进程若得不到阻抑或逆转，将可逐渐发展为肝硬化甚至预后极差的肝功能衰竭等终末期肝脏疾病，严重影响患者生存质量和预后。尽管国内外对肝纤维化发生发展分子机制及相应的防治策略的研究极其重视、并取得了一系列让人鼓舞的成就，但迄今尚无十分有效的减缓/逆转肝纤维化的手段。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）是存在于肝窦内皮细胞和肝细胞之间的肝脏窦周的狄氏间隙中的维生素A储存细胞，近几十年的深入研究表明HSC的活化增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。HSC在自身及肝细胞、血小板及窦内皮细胞分泌的多种细胞因子共同作用下，活化转变为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFs）发生表型及功能改变，通过旁分泌或自分泌机制，促使MFs增殖，合成大量的胶原和蛋白多糖等ECM，最终导致肝内形成大量胶原纤维。既往肝纤维化分子水平的研究绝大多数集中于HSC活化增殖、ECM合成相关信号通路：如细胞周期，凋亡通路，炎性因子、促纤维化因子等细胞因子，然而目前为止，针对肝星状细胞活化的治疗方法对临床肝纤维化的缓解/逆转效果尚不明确。随着表观遗传学水平调控作用在肝纤维化发生发展机制中的发现，miRNA这一非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)在肝纤维化进程中的作用正逐渐引起人们重视。microRNA（miRNA）是一类长度18-26nt的小分子非编码RNA，其通过与靶基因3’-UTRs的序列特异性结合的方式调节靶基因的表达，进而影响多种生理和病理过程。miRNA的突变、异常表达和异常加工均会影响其正常功能，在转录后水平影响基因表达，通过细胞内复杂网络状调控体系，对生物体的发育、分化、增殖、凋亡、免疫调控等生理活动进行精确调节。近年研究表明，miRNA可通过调控细胞增殖、凋亡、脂代谢/脂肪酸代谢等一系列相关信号通路在许多肝脏疾病的发生发展过程中发挥重要的生物学作用。基于对miRNA这一表观遗传学机制的逐步了解，为研究肝纤维化发生发展分子机制提供了新思路，因此寻找参与肝纤维化发生发展过程的关键miRNA和相关信号通路显得尤为重要。而有研究发现，多种miRNA可在体外HSC活化增殖进程中差异性表达，其中一些miRNA可参与HSC活化增殖相关调控机制，如miR-15b/16可通过调控细胞凋亡相关通路提升活化态HSC（aHSC）的凋亡率；miR-27a/27b可影响脂代谢，促进HSC活化增殖。提示miRNA可通过多种途径调控HSC生物学行为从而影响肝纤维化进程。通过研究miRNA在体内肝纤维化过程中的差异性表达，有助于更深入理解肝纤维化的发生发展机制，亦有助于寻找新型肝纤维化分子调控靶点。本课题拟通过检测二甲基亚硝胺（Dimethylnitrosamine，DMN）诱导的肝纤维化模型中各级肝纤维化组织miRNA表达谱，筛选肝纤维化进程中差异性表达miRNA，并通过相关生物信息学分析阐明差异性表达的miRNA及其靶基因主要参与调控的信号通路；进一步筛选差异表达显著miRNA的靶基因并进行验证。实验共分为三部分：第一部分，建立大鼠肝纤维化模型，对肝组织进行肝纤维化分级分组，为后期miRNA芯片表达谱研究做铺垫；第二部分，研究miRNA在肝纤维化进程中的差异表达情况并对差异显著的miRNA进行实时定量PCR验证，初步分析相关信号通路构建肝纤维化进程miRNA及其靶基因调控网络；第三部分，筛选差异表达显著的miRNA的靶基因并检测其是否参与肝纤维化进程。第一部分：大鼠肝纤维化模型建立目的:建立大鼠肝纤维化模型，观察随着造模周期延续，DMN对大鼠的一般情况及肝脏病理组织学改变，成功获得各级大鼠肝纤维化组织，为后期miRNA芯片表达谱研究做材料准备。方法：对SD大鼠行DMN连续腹腔内注射以建立SD大鼠肝纤维化模型，对照组大鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水。以7天为一周期定期观察大鼠一般情况改变并处死部分大鼠取肝组织采用HE染色及Masson、VG特殊染色法行病理学分析，判断大鼠肝纤维化程度。结果：（1）随着造模周期延续，大鼠一般情况都发生相应改变，模型组大鼠各时间段活动、排便、体毛密度和光泽度、体重均低于对照组；（2）造模早期大鼠肝脏较正常组稍大，后期肝脏体积则小于对照组，肝脏表面逐渐出现沙砾结节感；（3）HE染色及Masson、VG特殊染色观察：对照组肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，未见变性和坏死区。模型组均可见变性甚至坏死和炎性渗出，大鼠肝脏中逐步出现门管区和小叶内胶原纤维并最终形成纤维隔和假小叶（纤维化程度逐周加重）。结论：SD大鼠经DMN连续腹腔注射可成功诱导肝纤维化，经选取的各周肝组织可代表肝纤维化组织病理学分级特点，且与临床肝纤维化分级相符。第二部分：肝纤维化进程中差异表达miRNA筛选及生物信息学分析目的:研究miRNA在肝纤维化进程中的差异表达情况并进行验证，初步分析相关信号通路构建肝纤维化进程miRNA及其靶基因调控网络。方法：（1）根据前期肝纤维化组织病理分级分组结果选取各级肝纤维化组织，利用miRNA芯片初步筛选出在各级肝纤维化组织中差异性表达的miRNA；（2）实时定量PCR检测部分miRNA在不同级别肝纤维化组织中的表达（3）miRNA靶基因功能显著性分析和参与的代谢通路显著性分析，（4）构建靶miRNA与靶基因的调控网络，得到肝纤维化进程miRNA调控网络中起核心调控作用的miRNA和被miRNA调控的关键靶基因。结果：（1）miRNA芯片分析结果表明，随着肝纤维化发展，肝组织中有23条miRNA差异性表达；（2）选取芯片中表达水平上升最显著的miRNA进行实时定量PCR检测，结果表明在肝纤维化的进程中miR-34family发生了显著上调，此结果与芯片结果一致，其中miR-34a/34c的上调水平与大鼠肝纤维化程度呈正相关；（3）靶基因GO分析及pathway分析结果表明：差异性表达的miRNA及其靶基因参与的基因功能和相关信号通路中，脂代谢/脂肪酸代谢的基因功能及相关通路的富集度最高；（4）miRNA–Gene–Network分析结果显示长链酰基辅酶A合成酶家族成员1（ACSL1）位于调控网络中心，受5个miRNA共同调控。结论：肝纤维化进程中存在miRNA差异性表达，miR-34a/34c在纤维化肝脏中的上调水平与大鼠肝纤维化程度呈正相关，差异性表达miRNA的靶基因主要参与调控脂代谢/脂肪酸代谢相关通路，ACSL1受miR-34family等5个miRNA共同调控，可能是肝纤维化进程中重要调控分子。第三部分：ACSL1与miR-34famliy靶向关系检测及其与肝纤维化分级相关性研究目的：筛选miR-34famliy候选靶基因，验证miR-34famliy与ACSL1靶向关系，研究ACSL1在各级肝纤维化组织中的mRNA和蛋白表达水平。方法：（1）预测miR-34famliy所调控的靶基因，根据组织特异性筛选可出现在肝脏的候选靶基因；（2）利用绿色荧光蛋白（EGFP）报告系统对miR-34famliy和预测的靶基因ACSL1的靶作用关系进行验证；（3）利用实时定量PCR和Western-blot检测ACSL1在肝纤维化进程中的mRNA及蛋白表达水平并分析。结果：（1）ACSL1含有miR-34family的特异性结合位点；（2）经EGFP报告系统检测，ACSL1是miR-34a/34c的靶基因；（3）实时定量PCR和Western-blot技术检测结果表明，随着肝纤维化的发展，ACSL1mRNA转录水平和蛋白表达水平明显降低，这提示ACSL1可能是肝纤维化进程重要的调控分子。结论：ACSL1表达水平与肝纤维化进程成负相关，miR-34a/34c及其靶基因ACSL1可能是肝纤维化进程重要的调控分子。