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目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）作为世界上最常见的恶性肿瘤之一,具有发病隐匿、易转移、易复发的特点,目前尚无有效的治疗方法。阿帕替尼（Apatinib）是一种国产小分子抗血管生成靶向药,在治疗HCC方面被证实有效且安全,但患者在服药过程中常出现多种不良反应且易产生耐药性,这极大限制了Apatinib的临床应用。如何在减少Apatinib使用剂量的同时增加其治疗效果,具有重要的临床意义。p53作为肿瘤抑制因子,在HCC中多处于失活状态,且与治疗的耐药性高度相关。RG7112是第一个被批准用于临床实验的MDM2抑制剂,可通过结合MDM2激活p53,由此抑制肿瘤生长。内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）在内环境稳态恢复、细胞存活、细胞死亡等活动中发挥重要作用。ERS主要由PKR类似内质网激酶（PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）、肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme 1α,IRE-1α）、激活转录因子-6（activating transcription factor-6,ATF-6）、结合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein,Bi P）、Calnexin等蛋白调控。本研究在前期预实验中发现,Apatinib联合RG7112可发挥协同效应,通过改变ERS通路,诱导细胞凋亡,最终显著抑制HCC。研究方法:第一部分:体外培养人HCC细胞系HEPG2及QGY7701、人正常肝细胞HHL-5,在细胞水平探究Apatinib联合RG7112抑制HCC的作用效果及分子机制。使用HEPG2构建小鼠异种移植瘤模型,从动物水平验证两药联合对HCC的抑制作用。使用Cell Counting Kit-8试剂盒检测Apatinib联合RG7112对细胞活性的影响。使用Hoechst 33258染液观察两药联合对细胞核的改变情况。使用流式细胞术定量分析Apatinib联合RG7112诱导产生细胞凋亡的效应。使用Western blotting检测细胞及组织中凋亡相关蛋白表达的含量。通过transwell转移实验检测两药联合对细胞转移能力的影响。通过transwell侵袭实验检测Apatinib联合RG7112联合对细胞侵袭能力的影响。通过划痕实验检测Apatinib联合RG7112对HCC细胞创伤愈合能力的影响。通过集落形成实验检测两药联合对细胞克隆形成能力的影响。使用Western blotting检测细胞中上皮间质转化相关蛋白（epithelialmesenchymal transition,EMT）表达的含量。第二部分:体外培养人HCC细胞系HEPG2及QGY7701,探究Apatinib联合RG7112通过内质网应激通路诱导细胞凋亡的作用机制。使用内质网荧光探针观察Apatinib联合RG7112对细胞内质网的改变情况。使用钙离子荧光探针观察两药联合对细胞内钙离子的改变情况。使用Western blotting检测细胞中ERS相关蛋白的表达含量。使用小分子抑制剂4-PBA抑制细胞的ERS,评估ERS抑制对RG7112联合Apatinib诱导的细胞凋亡的影响。使用PERK si RNA下调ERS关键蛋白PERK的表达水平,评估PERK表达下调对两药联合应用诱导的细胞凋亡的影响。结果:第一部分:与单独使用Apatinib或RG7112相比,Apatinib联合RG7112可显著降低HCC的细胞活性,且具有时间依赖性。Apatinib联合RG7112作用于HCC细胞系QGY7701及HEPG2后,可显著诱导细胞核出现凋亡改变。流式细胞术的结果显示,与单独使用Apatinib或RG7112相比,Apatinib联合RG7112处理细胞后,凋亡细胞的比例明显增加,且具有时间效应。Western blotting结果显示,与对照组及单独处理组相比,两药联合处理细胞后,p53受到显著激活,且其下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin、Mcl-1下调明显,而促凋亡蛋白Cleaved PARP、Bak、Bax、Bad及上调明显。这表明Apatinib联合RG7112可通过激活p53诱导激活内源性凋亡通路。在体内实验中,与空白组、Apatinib单用组、RG7112单用组相比,Apatinib联合RG7112处理组的异种移植瘤的生长受到明显抑制,且肿瘤组织内的p53、Cleaved Caspase-3以及Cleaved PARP的表达均明显上升。这提示Apatinib联合RG7112在体内同样可通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长。通过transwell转移实验及划痕愈合实验的结果可知,两药联合可抑制HCC细胞的迁移能力。通过transwell侵袭实验的结果可知,Apatinib联合RG7112可抑制细胞的侵袭能力。集落形成实验的结果表明,与单用Apatinib或RG7112相比,联用Apatinib和RG7112可显著抑制QGY7701及HEPG2的克隆形成能力。Western blotting结果进一步证实,与对照组及单独处理组相比,两药联用组的上皮标志物E-Cadherin的表达明显上调,而间质标志物N-Cadherin及Vimentin的表达明显下调。这提示联用Apatinib和RG7112可通过阻断EMT抑制细胞的侵袭及转移能力。通过培养正常人肝细胞HHL-5,评估在有效浓度下两药联用对正常肝细胞的影响。结果可见,使用相同的药物浓度处理细胞后,与QGY7701相比,正常人肝细胞HHL-5的数目及形态均未发生变化,且凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP均未被诱导激活。第二部分:通过内质网荧光探针对细胞进行染色后可知,Apatinib联合RG7112可显著激活内质网的膜电位,表明ERS在两药联用中的重要作用。钙离子荧光探针染色的结果可知,与单独使用Apatinib或RG7112处理细胞相比,Apatinib联合RG7112处理细胞后,细胞质内的钙离子浓度明显上升。这说明两药联合处理细胞可使大量的钙离子由内质网释放到细胞质,进一步证实内质网改变在Apatinib联合RG7112处理细胞中的重要作用。Western blotting结果显示,与单用Apatinib或RG7112相比,Apatinib联合RG7112可增加ATF-4及CHOP的表达,并降低ATF-6、Bi P、Calnexin、IRE-1α、PERK的表达,且具有时间依赖性。4-PBA是一种ERS抑制剂,使用4-PBA抑制细胞中的ERS后,可见Apatinib联合RG7112诱导的凋亡效应亦受到抑制。PERK在ERS依赖性的细胞凋亡中发挥重要作用。直接使用si RNA抑制PERK的表达,可增强Apatinib联合RG7112诱导的细胞凋亡效果。结论:在体内及体外实验中,使用Apatinib联合RG7112处理HCC细胞,可靶向p53-PERK信号通路,激活ERS,并诱导Caspase 3依赖性细胞凋亡,最终抑制HCC的发生发展。此外,Apatinib联合RG7112可通过改变EMT抑制细胞的侵袭、转移及克隆形成能力,提示两药联合可减少HCC的侵袭性及转移性。更重要的是,有效浓度的Apatinib联合RG7112对体外培养的正常人肝细胞不产生毒性,表明Apatinib联合RG7112用于肝癌治疗的安全性。本研究揭示了抗血管生成靶向药Apatinib联合小分子p53激活剂RG7112作用于HCC治疗的效果及机制,或可为HCC的治疗提供新的思路及方法。