肥胖症是一种营养障碍性疾病,典型特征为超重,脂肪过多,原因主要是能量代谢失调,出不敷入。与单纯性肥胖不同,过度肥胖会成为多种代谢疾病的诱因,比如糖尿病、心血管疾病、慢性肾病等。其在2003年被世界卫生组织定义为全球性流行病,患病率在未来十年估计会增长40%,已成为危害人类健康的主要疾病之一。而现代肥胖发生的诸多诱因中不规律饮食及饮食结构不合理,机体摄入过多热量成为主要因素。长期的高热量饮食(高脂肪、高蛋白、高糖)会诱导肥胖的发生,引起人体代谢紊乱,促进各种并发症,危害极大。在现实生活中,人们发现:同样摄入高脂饮食的人,有的人就是“吃不胖”,有的人摄入量很有限,但仍然容易长胖,自称“喝水也胖”。可见,肥胖有个体代谢与遗传学差异。对于高脂饮食诱导的群体除了人类以外,小鼠作为科学研究中普遍运用的实验动物屡屡被用到。早在20世纪80年代初期,Levin等用高脂饮食饲喂同一批次Sprague-Dawley大鼠后发现,一部分大鼠会发生肥胖,称为饮食诱导的肥胖(diet-induced obesity,DIO),而另一部分大鼠并未发生肥胖,称为饮食诱导的肥胖抵抗(diet-induced obesity resistance,DIOR)。由此可见,同种动物不同个体对于高脂饮食诱导的肥胖易感性存在差异。近年的研究表明,高脂饮食会影响人体肠道菌群的组成结构和功能,而肠道菌群被称为人体的“第二基因组”,能参与调节多种代谢途径,维持肠道微生态平衡,其中脂代谢、碳水化合物代谢等与肥胖的发生有着密切的关系,而人们对肠道菌群与个体肥胖易感性的关系远没有那么清晰的认识。得益于宏基因组学的发展,我们对于肠道菌群的结构功能有了进一步了解,借助于生物信息学分析工具,能让我们深入了解肠道菌群与高脂饮食诱导的不同个体肥胖易感性的关系,有助于深入探索肠道菌群在肥胖发生中扮演的角色。本研究利用高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠用以建立肥胖和肥胖抵抗模型,通过宏基因组学分析比较不同模型小鼠肠道菌群在结构组成与功能上的差异,探讨肠道菌群与肥胖及肥胖抵抗之间的联系。以下为主要研究内容及结果:1.高脂饮食小鼠模型的构建及判定:取30只C57BL/6J小鼠,10只作为对照,饲喂普通饲料,20只作为模型组,饲喂高脂饲料。造模期结束后,超过对照组小鼠体重平均增长率的2倍的小鼠划定为“高脂饮食诱导肥胖组”(HFDIO组),共8只,其余未达到肥胖标准的称为“高脂饮食诱导肥胖抵抗组”(HFDIOR组),共12只。2.小鼠粪便的收集与基因组DNA提取,宏基因组测序:采用腹部按摩法在造模期结束后取小鼠新鲜粪便,按照QIAamp?Fast DNA Stool Mini kit说明书(购自德国QIAGEN公司)提取粪便中的DNA,检测浓度、纯度,琼脂糖凝胶电泳检测基因组完整性后,基因组样品置于干冰中,委托深圳华大基因科技服务有限公司测序。质检后选择未降解的18个样品(Control 6只,HFDIO 7只,HFDIOR 5只)进行宏基因组文库构建与测序,并进行数据质控、过滤、组装和基因集构建。3.高脂饮食诱导的小鼠肠道菌群物种注释与物种丰度分析:所得基因集与NCBI非冗余蛋白数据库nr进行比对。经过物种注释及丰度分析发现,相比Control组,HFDIO组和HFDIOR组小鼠肠道拟杆菌门显著下降,厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门含量显著升高。HFDIO组和HFDIOR组小鼠肠道在变形菌门、螺旋体门、疣微菌门有一定差异,而在厚壁菌门、梭杆菌门、变形菌门差异上有统计学意义(P<0.05)。4.宏基因组多样性分析:多样性分析分为α多样性分析和β多样性分析。通过α多样性分析发现Control组肠道菌群多样性远高于高脂组小鼠,HFDIO组和HFDIOR组差异不明显。通过β多样性分析发现,Control组、HFDIO组与HFDIOR组无论在物种组成,基因功能还是代谢途径上都存在较大差异。物种组成上,高脂饮食诱导的2组小鼠趋于相似,并有交互,但与对照组有较大差距,聚类分析提示有性别差异;而在基因功能和代谢途径上,3组小鼠都有明显差异,Control组与HFDIOR组距离较近,提示在关键基因功能上HFDIOR组小鼠的肠道菌群未受到较大损伤,HFDIO组小鼠可能已处于代谢紊乱状态。5.宏基因组关键生物标记物的筛选:通过线性判别效应量(LEfSe)分析,发现Control组的关键物种是拟杆菌属和普雷沃氏菌属,从属于拟杆菌门;HFDIO组的关键物种只有Lachnospiraceae bacterium28-4,从属于厚壁菌门;HFDIOR组最关键的物种是Lachnospiraceae bacterium10-1,从属于厚壁菌门。6.GO功能显著性差异分析:通过基因本体(Gene Ontology,GO)数据库分析比对,我们发现,HFDIO组和HFDIOR组小鼠在细胞组成、分子功能、生物学途径都存在较大差异,差异有统计学意义(P<0.05)的共有23项,重要差异有氧还原酶活性、转移酶活性、核酸结合活性。7.KEGG Pathway差异分析:通过将基因与KEGG(京都基因与基因组百科全书)数据库中的代谢通路分析数据库比对,我们发现,HFDIO组和HFDIOR组小鼠存在较大差异,差异有统计学意义(P<0.05)的共有17项,关键差异集中在碳水化合物代谢。8.高脂饮食诱导的小鼠肠道病毒物种注释与物种丰度分析:通过比对NCBI的nr、virus数据库发现,相比Control组,HFDIO组和HFDIOR组小鼠肠道肌尾噬菌体科、微小噬菌体科有所下降,HFDIOR组短尾噬菌体科下降明显。HFDIO组和HFDIOR组小鼠肠道病毒未发现显著差异(P>0.05)。9.病毒组与肠道细菌关联网络分析:18类病毒与46种细菌产生183条关联网络线条,其中82条为负相关,其余101条为正相关。首次在小鼠肠道中发现大量主要宿主为拟杆菌属的crAssphage。综上所述,我们通过宏基因组对高脂饮食诱导的肥胖小鼠和肥胖抵抗小鼠在肠道菌群群落结构组成,关键物种,基因功能和代谢途径的比较得出,高脂饮食诱导的肥胖组和肥胖抵抗组小鼠在个体肥胖易感性上确实有很大不同,推测关键菌群的基因功能对肥胖的发生或抵抗有着重要的作用,进一步对这些关键基因以及crAssphage进行研究有助于正确评价肠道菌群与肥胖之间的关系,为肥胖的发生机制及控制策略提供理论基础。