背景和目的大肠癌是严重危害人类健康也是最常见的恶性肿瘤之一,在西方发达国家其发病率居于恶性肿瘤的第2位,在我国随着人类生活水平的提高及膳食结构的改变,其发病率和死亡率均呈明显上升趋势。但是,由于大肠癌起病隐匿、进展较快、早期诊断困难,患者就诊时常处于中晚期,故失去手术机会的病例较多,部分患者接受放化疗后仍早期复发,直接导致大肠癌预后差,病死率高,所以研究大肠癌的发病机制,寻找治疗靶点,对大肠癌的治疗非常重要。肿瘤的发生、发展是一个多因素参与、多基因改变、多步骤发展的复杂过程。在肿瘤的研究过程中,人们提出的肿瘤干细胞学说认为肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中极少量的肿瘤细胞亚群,具有自我更新、增殖、分化、强致瘤性等潜能,与肿瘤发生、发展、复发、转移和耐药密切相关。肿瘤干细胞则是肿瘤不断生长、肿瘤复发与转移的罪魁祸首,因此,肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点。目前,恶性肿瘤常见的肿瘤干细胞标志物有CD133、CD44、ESA、ALDH1等,其中CD133是目前被多数学者公认的肿瘤干细胞标志物,分选CD133+肿瘤干细胞亚群是富集大肠癌干细胞的一种有效方法,已应用于多种类型肿瘤干细胞的筛选。Fang DD等发现CD133+大肠癌细胞亚群是具有干细胞特征,认为CD133是大肠癌干细胞的标志物。Dalerba P等研究证明CD44是大肠癌干细胞标志物。我们前期的研究将Colo205细胞进行无血清培养和联合检测CD133及CD44的表达,为本实验对大肠癌干细胞的研究奠定基础。肿瘤免疫编辑学说认为在肿瘤的整个发展过程中,机体免疫系统和肿瘤细胞之间存在着相互作用,免疫系统重塑肿瘤细胞的抗原性,肿瘤细胞影响着免疫系统的功能。从细胞发生恶性转化开始到临床上出现可检测到的肿瘤为止,免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用分为三个阶段：清除阶段,平衡阶段,逃逸阶段。在肿瘤发生之前,免疫系统会识别肿瘤细胞和起到免疫杀伤作用。但是,肿瘤干细胞可以利用免疫逃逸机制,可能对肿瘤产生免疫抑制或免疫耐受。由此可见,大肠癌肿瘤干细胞的存在与肿瘤免疫之间的密切关系,是使肿瘤不断发展的重要原因。肿瘤干细胞理论指出结肠癌的发病、转移与复发与大肠癌干细胞有关。然而,机体免疫系统对大肠癌干细胞的免疫识别、大肠癌肿瘤干细胞在诱导肿瘤免疫调节和免疫耐受的作用及其机制仍然不明确,针对大肠癌干细胞免疫治疗也在起始阶段。因此,进一步探讨和研究大肠癌干细胞与肿瘤免疫之间的关系至关重要。研究表明CD200具有免疫调节作用,CD200是一种Ⅰ型膜糖蛋白,是高度保守的免疫超家族成员,可以表达在骨髓系统的细胞中包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞,同样表达在B细胞、活化T细胞等。Moreaux J等证实CD200mRNA高表达于结肠癌、肾癌、头颈部癌等肿瘤中,并且高表达者具有更差的预后。Kawasaki BT等通过流式检测发现CD200与前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、结肠癌的肿瘤干细胞表面标志物例如CD44,CD133等共表达,提出CD200可能是前列腺癌、乳腺癌、脑瘤、结肠癌的肿瘤干细胞的表面标志物之一。最近研究已证实CD200在器官移植、自身免疫疾病、肿瘤免疫中有重要的作用并与疾病的发生、发展有关。为此让CD200在大肠癌干细胞研究奠定了基础,也提示CD200介导的大肠癌干细胞与肿瘤免疫密切相关。目前,CD200在大肠癌的研究仍处于初步阶段,本实验对CD200与大肠癌细胞CD133及ALDH1共表达及其之间的相互关系进行初步研究。为CD200介导的大肠癌肿瘤免疫研究,以及大肠癌预后的指导、靶向治疗等方面提供了新的科研视角。因此,研究CD200与大肠癌干细胞之间的关系,寻找治疗的靶点,对大肠癌的治疗至关重要。材料与方法1.细胞培养含血清培养基(serum-supplimented medium, SSM)为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,无血清培养基(serum-free medium,SFM)由DMEM/F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、LIF(10ng/ml)组成。将Colo205细胞接种于SSM中培养,细胞处于生长期时用PBS液清洗,胰酶消化,重悬Colo205细胞接种到SFM中进行培养。2.流式细胞检测离心收集SSM组和SFM组(培养2周)的Colo205细胞,分别取80u1细胞悬液(约含106个细胞),加入FCR阻断剂、Anti-CD200-APC、 Anti-CD133-PE标记,4℃孵育20分钟,并设有同型对照组,上机检测CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200’细胞的比例。3.细胞免疫荧光将SFM组的肿瘤细胞离心收集,以SSM组作为对照,加PBS重悬细胞后涂片,4%多聚甲醛固定,0.2%Triton X-100破膜,10%正常山羊血清封闭,加入鼠抗人CD133抗体、兔抗人ALDH1抗体(或鼠抗人CD200抗体、兔抗人ALDH1抗体)混匀4℃孵育过夜,PBS洗涤后加入anti-mouse-594、 anti-rabbit-488荧光标记二抗,并设有阴性对照,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染细胞核,抗荧光淬灭剂封片,镜检。4.流式细胞分选将SFM组大肠癌细胞离心收集(约1×108个细胞),加入FCR阻断剂、Anti-CD200-APC、Anti-CD133-PE标记,4℃孵育20分钟,上机进行流式细胞分选,并分选出CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133"CD200-四组细胞,培养后再进行第二次流式细胞检测。5.倒置显微镜观察细胞的形态及生长状况倒置显微镜观察含血清培养基和无血清培养基中Colo205细胞的形态和生长状况；用同样的方法观察无血清培养基中CD133+CD200-、CD133’CD200+、CD133+CD200+及CD133’CD200-细胞的形态和生长状况。6.NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验动物实验经过南方医科大学南方医院伦理委员会审核批准,并在南方医科大学南方医院实验动物中心SPF级饲养环境中饲养。将分选后的CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-细胞,分别用PBS重悬,取100ul单个细胞悬液与100ul Matrigel胶1：1(V/V)混合,并分别按103、104、105个CD133+CD200-、CD133-CD200+及CD133+CD200+细胞无菌皮下注射注入NOD/SCID小鼠左上背部,并以同样细胞数的CD133-CD200-细胞注射右下背部作为对照。每2天观察一次,用游标卡尺测量瘤体大小,记录瘤体的变化,瘤体体积用以下公式计：V=(π×L×W2)/6(V,体积；L,长；W,宽),绘制成瘤生长曲线,32天后将NOD/SCID小鼠安乐死,剔除出肿瘤组织。7.HE染色和免疫组织化学染色HE染色：将小鼠的皮下肿瘤组织用4%多聚甲醛固定,乙醇和二甲苯脱水和透明,石蜡包埋、石蜡切片HE染色。免疫组化染色：石蜡切片,用二甲苯、乙醇脱蜡和水化,3%过氧化氢孵育,加入EDTA抗原修复液并于微波炉进行抗原修复,PBS洗涤后加10%正常山羊血清封闭,兔抗人ALDH1抗体(1：200)4℃孵育过夜,以PBS代替一抗作阴性对照,加入二抗,DAB显色,苏木素复染,分化和返蓝,乙醇脱水和二甲苯透明,中性树胶封片。8.统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析,实验结果用均数±标准差表示,两组均数的比较采用独立样本t检验和两个独立样本非参数检验,多组均数比较采用One-Way ANOVA和多个独立样本参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.流式检测CD133+细胞与CD200+细胞的比例在SSM组Colo205细胞CD133+CD200"、CD133"CD200+及CD133+CD200+细胞的比例分别为(1.68±0.94)%、(0.9±0.67)%、(0.68±0.22)%,而在SFM组的比例分别为(19.7±2.36)%、(9.5±1.00)%、(3.0±0.93)%,两组间各细胞比例差异有统计学意义,P值均小于0.05。SFM组CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+细胞的比例均高于SSM组。将Colo205细胞在SFM中进行培养,CD133+CD200-、CD133"CD200+和CD133+CD200+细胞的比例明显升高,无血清培养基有利于CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+细胞的增殖生长。流式结果显示,CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133"CD200-细胞流式分选后,流式细胞检测纯度达到90%以上。2.倒置显微镜观察细胞形态及生长状况将Colo205细胞在SFM中培养,第1天观察发现大部分细胞贴壁生长,第2-6天,部分细胞悬浮并紧密连接生长,另一部分细胞凋亡,第7天后,开始形成不规则的肿瘤干细胞球,球内细胞折光性好,连接紧密,不能准备区分细胞与细胞间界限。随着细胞的继续传代,肿瘤细胞能够自我更新和保持增殖生长,仍然能在无血清培养基中生长并逐渐形成肿瘤干细胞球。而常规SSM培养的Colo205细胞不能形成肿瘤干细胞球。我们将SFM中的大肠癌细胞利用流式分选所得的CD133+CD200-、 CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四组细胞重悬于SFM中培养,发现CD133+CD200-和CD133+CD200+细胞能够形成肿瘤干细胞球,而CD133-CD200+、CD133CD200-细胞则不能形成肿瘤干细胞球,随着细胞连续传4代,CD133"CD200+仍能在无血清培养基中生长,而CD133"CD200-细胞逐渐出现凋亡。3.细胞免疫荧光将SSM组和SFM组的大肠癌细胞进行CD133、CD200、 ALDH1细胞免疫荧光鉴定。发现SFM组中大肠癌干细胞球高表达CD133、 CD200及ALDH1,并且CD133和ALDH1, CD200和ALDH1两者共表达。而SSM组CD133、CD200、ALDH1低表达或者阴性表达。4.NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验为了研究CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133’CD200-四组细胞的致瘤能力,我们分别将细胞注射入NOD/SCID小鼠皮下。我们的研究发现103个CD133+CD200-、CD133+CD200+细胞足以形成肿瘤,而同样细胞数的CD133"CD200+、CD133"CD200"细胞则不能形成肿瘤。104CD133+CD200+组在第8天开始形成肿瘤,104CD133+CD200-组在第14天开始形成肿瘤,104CD133+CD200+、CD133+CD200-、CD133-CD200+组分别在第8、16、24、32天形成的肿瘤体积差异有统计学意义,P值分别为0.025,0.020,0.000,0.002,其中104CD133+CD200+组更快形成肿瘤,且在第32天肿瘤体积比同样细胞数CD133+CD200-、CD133-CD200+组形成肿瘤体积大,而104个CD133"CD200-细胞则不能形成肿瘤。104CD133+CD200+、 CD133+CD200-和CD133-CD200+组32天后肿瘤组织的重量分别为(0.46±0.16)g,(0.27±0.05)g和(0.07±0.02)g。三组及两两之间肿瘤组织的重量差异有统计学意义,P值均小于0.05。CD133+CD200+组肿瘤重于CD133+CD200-、 CD133-CD200+组；而CD133+CD200-组重于CD133-CD200+组。我们的研究结果显示CD133+CD200+细胞表现出具有更强的致瘤能力。5.HE染色及ALDH1表达对105个CD133+CD200-、CD133-CD200+、 CD133+CD200+及CD133-CD200’组的肿瘤标本进行HE染色和ALDH1免疫组织化学检测,研究发现四组肿瘤组织均为低分化,而ALDH1主要表达在肿瘤细胞的细胞质中,CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+组的肿瘤组织ALDH1表达均为阳性,而CD133-CD200-组ALDH1表达弱阳性。结论1.CD200与CD133+Colo205大肠癌细胞共表达流式检测发现CD133+细胞与CD200-细胞在无血清培养基中培养2周后细胞比例明显升高,表明CD133+细胞与CD200+细胞能够在无血清培养基中自我更新和增殖生长。本实验发现CD200与CD133+Colo205细胞共表达的细胞亚群,且CD200+细胞中大部分是CD133+CD200+细胞。2.大肠癌干细胞球高表达CD133、CD200及ALDH1无血清培养Colo205细胞形成的大肠癌干细胞球高表达CD133、CD200及ALDH1,且CD133与ALDH1, CD200与ALDH1共表达。CD133是未分化的标志,表明大肠癌干细胞球富含未分化细胞,CD200在大肠癌干细胞球高表达,推测CD200与大肠癌干细胞有着密切的关系。3.CD133+CD200+细胞能够形成肿瘤干细胞球及具有更强的致瘤能力筛选所得的CD133+CD200+细胞仍能在无血清培养基中形成肿瘤干细胞球,具有自我更新和增殖生长的特性。动物成瘤实验显示CD133+CD200+细胞具有更强的自我更新、增殖分化和致瘤能力。4.CD133+CD200+细胞可能是大肠癌干细胞其中一个细胞亚群,CD200可能作为大肠癌干细胞候选的表面标志物之一流式结果显示CD133+CD200+细胞占肿瘤细胞的极少数,符合肿瘤干细胞的定义之一,及其具有更强自我更新、增殖分化和致瘤能力,能够在无血清培养基中形成肿瘤干细胞球。CD200与大肠癌干细胞表面标志物CD133共表达,且与肿瘤免疫中免疫逃逸的机制及肿瘤复发密切相关,由此推测CD133+CD200+细胞可能是大肠癌干细胞其中一个细胞亚群,CD200可能作为大肠癌干细胞候选的表面标志物之一。5. ALDH1在大肠癌干细胞及大肠癌发展中起到重要的作用ALDH1在大肠癌干细胞球中高表达,并且成瘤实验中发现小鼠体内的肿瘤组织ALDH1表达,因此,推测ALDH1可能也是大肠癌干细胞表面标志之一,临床上检测大肠癌组织ALDH1的表达,对大肠癌的诊疗及预后评估有一定的指导作用。