异槲皮苷是芦丁的脱鼠李糖基产物,现代药理学研究表明异槲皮苷的药理活性明显高于芦丁,药用价值较高;薯蓣皂苷元是合成性激素等甾体激素类药物的重要前体化合物,还具有抗肿瘤、抗氧化以及改善心血管功能障碍等多种生物活性。这两种中药活性成分在植物中的天然含量较低,工业上常常采用酸水解法,高压水解法等方法进行制备,无机酸使用量较多,废水排放量大,造成了严重的环境污染。微生物转化、酶催化转化等生物技术本质上是利用游离酶或复合酶对外源化合物进行结构修饰的代谢反应,具有条件温和、选择性强、副产物少、清洁环保、成本较低等优点;天然苷类化合物通常含有较多糖基,极性很大,因此并不是发挥其药理活性的最佳结构,将其转化为低糖苷、苷元或其他产物,有助于更好地发挥药效。本论文研究将重组表达的α-L-鼠李糖苷酶应用于芦丁的生物转化,建立了更为清洁、高效地制备异槲皮苷的技术;此外,基于微生物转化建立了高效、经济地制备薯蓣皂苷元的技术,并对其中的关键水解酶进行了分离。研究内容主要包括以下几个部分:1.重组α-L-鼠李糖苷酶的表达。首先采用全化学合成的方法对α-L-鼠李糖苷酶基因进行合成并将其插入到pPIC9K载体中;接着通过电转化的方式将其整合至毕赤酵母GS115基因组中,获得抗G418的高拷贝数的阳性转化子;然后对甲醇诱导产酶条件进行了优化。结果表明,当培养基初始pH值为6.5,甲醇添加量为1.5%(v/v),诱导培养6 d后,酶的活性最高;重组酶的底物特异性结果显示,重组α-L-鼠李糖苷酶可以选择性地水解芦丁并生成生物活性更高的异槲皮苷,但不能脱去薯蓣皂苷末端的鼠李糖基,该部分研究为酶催化法制备异槲皮苷奠定了基础。2.酶催化转化芦丁制备异槲皮苷的研究。首先,比较了柚苷酶和重组α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的转化效果,并以芦丁转化率为指标优化了酶水解条件;然后,放大反应量并采用HPD-100大孔吸附树脂柱色谱对酶解产物进行了纯化。结果显示,当酶/芦丁质量比为1:4,酶解时间为30 mins,反应温度为60℃,酶解体系pH值为4.5时酶解效果最好;当芦丁浓度提高到20 g/L时,2 hrs内可全部转化为异槲皮苷,经HPD-100大孔吸附树脂纯化后得到了异槲皮苷,其纯度为97.03%。此外,酶解过程中产生的另一产物鼠李糖也具有较高的经济利用价值,且与传统的酸水解法相比,酶水解法特异性较高,副产物少,因此,该技术具有良好的发展前景。3.微生物转化制备薯蓣皂苷元的研究。首先,选用四种商品酶及重组α-L-鼠李糖苷酶对黄姜粗皂苷进行转化,结果显示五种水解酶均不能将皂苷转化为薯蓣皂苷元;随后采用微生物转化法,并比较了米曲霉、黑曲霉、烟曲霉以及盾叶薯蓣内生菌对薯蓣皂苷元的产率的影响;接着优化了发酵条件,并放大了发酵体系。结果表明,在所选菌种中,烟曲霉为最佳产酶菌;当发酵时间为5 d、底物浓度为30 g/L(以鲜黄姜的量计算)、接种量为2.0%(v/v)、发酵温度为33℃、发酵培养基的初始pH值为自然pH时,薯蓣皂苷元的产率最高可达1.57±0.07%。将发酵体系放大10倍和20倍后,产率分别为1.50±0.21%和1.46±0.05%,高于直接酸水解法,表明该方法在工业实践中具有良好的应用前景。4.微生物产薯蓣皂苷水解酶的分离与纯化。首先,底物特异性研究发现微生物产薯蓣皂苷水解酶粗酶具有β-葡萄糖苷酶的活性,本部分对其中的β-葡萄糖苷酶进行了初步的分离纯化。将粗酶液依次经硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换柱层析、Phenyl Sepharose HP疏水层析分离纯化;然后分别用酶活力追踪和SDS-PAGE方法对其分离组分进行检测。结果显示,粗酶经分离后共得到两个具有β-葡萄糖苷酶活性的组分;其中酶组分E1的回收率为8.83%,纯化倍数为90.70倍,另一酶组分E2的回收率为14.04%,纯化倍数为116.91倍;SDS-PAGE分析结果显示两个活性酶组分仍含有少量杂蛋白,需要进一步纯化以期获得纯度较高的单一活性酶,为酶转化法制备薯蓣皂苷元技术的研究奠定基础。