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目的探讨通过慢病毒介导人结肠腺癌RKO细胞中的鞘氨醇激酶-1(Sphingosine kinase-1,SphK1)基因沉默后对化疗药物顺铂(cisplatin,DDP)敏感性的影响及其可能的作用机制。方法通过重组DNA技术,设计和合成特异性针对SphK1基因的pLenti6.3-shRNA-SphK1慢病毒表达载体,同时无义序列pLenti6.3-EGFP慢病毒载体作为阴性对照,感染人结肠腺癌RKO细胞株,然后采用杀稻瘟菌素(blasticidin,BSD)来筛选,以获得稳定不变低表达SphK1基因的单一克隆RKO稳转细胞株。根据是否转染,以及转染的处理方式分为SphK1敲低组(shSphK1组)、阴性转染对照组(NC组),同时将未予转染处理的原始RKO细胞记作空载对照组(Control组)。为验证基因的沉默效率,在荧光倒置显微镜下检测转染后各组细胞的EGFP(绿色荧光)的表达情况,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)法检测Sph K1的mRNA水平,以及Western blot法检测SphK1的蛋白表达水平。根据是否暴露于DDP,将实验分为非DDP组和DDP组两个大组。非DDP组包括shSphK1组、Control组和NC组;DDP组则记为shSphK1+组、Control+组和NC+组。然后以不同剂量(0、2、4、8、16、32μg/ml)的DDP分别作用于细胞24、48、72小时后,利用MTT法检测各组细胞的增殖活性。采用原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡。Western blot法检验增殖标志蛋白Ki-67以及凋亡标记蛋白Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达变化程度。结果在荧光倒置显微镜下,shSphK1组和NC组可观看到多量的egfp(绿色荧光)的表达。rt-qpcr法和westernblot法均表明shsphk1组的sphk1表达显著低于control组及nc组(p<0.05)。mtt结果显示shsphk1组、control组和nc组细胞24h的增殖活性分别为(1.1063±0.0316)、(1.2821±0.0463)、(1.2508±0.0365),以上三组细胞48h的增殖活性分别为(1.1937±0.0347)、(1.5733±0.0554)、(1.5314±0.0572),三组细胞72h的增殖活性分别为(1.2288±0.0495)、(1.6907±0.0785)、(1.6667±0.0658);shsphk1组24、48、72h的细胞增殖活力显著比control组及nc组减小(p<0.05),这提示沉默sphk1基因能够降低rko细胞的增殖活力。mtt结果还显示以2μg/ml的ddp处理shsphk1+组、control+组和nc+组细胞24h后的细胞增殖活性分别为(0.7587±0.0422)、(0.9379±0.0535)、(0.9189±0.0512),48h的细胞增殖活性分别为(0.6675±0.0429)、(0.8151±0.0704)、(0.7868±0.0893),72h的细胞增殖活性分别为(0.5224±0.0535)、(0.7510±0.0632)、(0.7456±0.0605);以4μg/ml的ddp处理细胞24h后的细胞增殖活性分别为(0.6332±0.0303)、(0.8561±0.0697)、(0.8364±0.0714),48h的细胞增殖活性分别为(0.5236±0.0219)、(0.7121±0.0253)、(0.6971±0.0536),72h的细胞增殖活性分别为(0.4035±0.0709)、(0.6495±0.0375)、(0.6002±0.0218);以8μg/ml的ddp处理细胞24h后的细胞增殖活性分别为(0.5447±0.0399)、(0.7683±0.0402)、(0.7409±0.0622),48h的细胞增殖活性分别为(0.4343±0.0529)、(0.5938±0.0701)、(0.5576±0.0365),72h的细胞增殖活性分别为(0.2781±0.0195)、(0.4725±0.0427)、(0.4543±0.0594);以16μg/ml的ddp处理细胞24h后的细胞增殖活性分别为(0.4575±0.0622)、(0.6387±0.0899)、(0.6193±0.0323),48h的细胞增殖活性分别为(0.2519±0.0353)、(0.4163±0.0532)、(0.3952±0.0413),72h的细胞增殖活性分别为(0.1472±0.0477)、(0.3061±0.0319)、(0.2707±0.0242);以32μg/ml的ddp处理细胞24h后的细胞增殖活性分别为(0.2867±0.0746)、(0.4519±0.0698)、(0.4298±0.0706),48h的细胞增殖活性分别为(0.1120±0.0493)、(0.2194±0.0389)、(0.1888±0.0439),72h的细胞增殖活性分别为(0.0478±0.0073)、(0.1399±0.0231)、(0.1040±0.0365)。以上结果显示ddp呈时间和剂量依赖性抑制各组细胞的增殖,并且在同一浓度的ddp作用相同时间的条件下,shsphk1+组细胞的增殖能力显著低于control+组和nc+组(p<0.05)。tunel法结果显示未予ddp处理的shsphk1组细胞凋亡率(13.54±2.19)%明显高于control组(5.04±1.05)%和nc组(6.15±1.56)%(p<0.05)。予8μg/ml的ddp处理shsphk1+组、control+组和nc+组细胞24h后的细胞凋亡率则分别为(25.91±3.01)%、(18.68±3.16)%、(19.28±2.97)%;予16μg/ml的ddp处理以上三组细胞24h后的细胞凋亡率分别为(55.26±4.71)%、(35.82±3.97)%、(37.52±3.51)%;予32μg/ml的ddp处理三组细胞24h的细胞凋亡率分别为(76.04±4.52)%、(59.60±4.87)%、(62.28±3.11)%;以上结果说明ddp呈浓度依赖性诱导rko细胞凋亡,并且shsphk1+组细胞的凋亡率明显高于control+组和nc+组(p<0.05)。westernblot法检测沉默sphk1后,shsphk1组、control组和nc组ki-67蛋白的相对表达量分别为(0.9410±0.0437)、(1.1592±0.0753)、(1.1543±0.0981),bcl-2蛋白的相对表达量分别为(0.7317±0.0374)、(0.9180±0.0633)、(0.9205±0.0495),caspase-9蛋白的相对表达量分别为(0.4367±0.0757)、(0.2317±0.0593)、(0.2495±0.0435),caspase-3蛋白的相对表达量分别为(0.6479±0.0762)、(0.3989±0.0499)、(0.3942±0.0614)。以16μg/ml的ddp处理shsphk1+组、control+组和nc+组细胞24h后,ki-67的相对表达量分别为(0.3105±0.0367)、(0.8049±0.0684)、(0.8138±0.0596),bcl-2的相对表达量分别为(0.2329±0.0389)、(0.5203±0.0312)、(0.5270±0.0497),caspase-9蛋白的相对表达量分别为(1.8941±0.1025)、(0.8627±0.0624)、(0.8785±0.0858),caspase-3蛋白的相对表达量分别为(2.5849±0.1586)、(0.8955±0.0735)、(0.8872±0.0942)。结果显示敲低SphK1后,Ki-67和Bcl-2的表达减弱,Caspase-9和Caspase-3的表达增强;经DDP处理后,shSphK1+组的Ki-67和Bcl-2蛋白表达水平较Control+组和NC+组明显减少(P<0.05);shSphK1+组的Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平与Control+组和NC+组相比显著增强(P<0.05)。结论沉默SphK1基因可以抑制结肠癌RKO细胞的增殖活力,下调SphK1基因可能通过抑制Bcl-2的水平和激活Caspase 9/3的表达促进RKO细胞的凋亡,抑制SphK1基因可能通过激活Caspase-9/3依赖的细胞凋亡信号通路增强结肠癌RKO细胞对DDP的化疗敏感性。