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目的：
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)在人群中呈现高感染率，严重危害人类健康。用Hp核酸疫苗预防Hp感染的报道不多，且效果不甚理想。本研究拟构建壳聚糖包裹的Hp粘膜核酸疫苗，采用与抗原共表达细胞因子的方式来增强和调控免疫反应，同时观察疫苗诱导的免疫应答与抗Hp定植之间的关系，进一步揭示疫苗可能的保护性机制。
方法：
1.以Hp标准株NCTC11637基因组为模板，PCR扩增hpaA及ureB基因，亚克隆至pMD18-T载体，酶切并测序鉴定后，克隆至真核表达载体pTCAE，构建pT-H和pT-U，并分别转化DH5α。抽提质粒电穿孔法转染CHO细胞，间接免疫荧光法及免疫印迹法检测目的蛋白的表达。分别将pT-H、pT-U注射小鼠股四头肌，检测血清中特异性IgG水平。
2.RT-PCR法从小鼠脾脏中扩增GM-CSF、IL4基因，亚克隆至pMD18-T载体，酶切并测序鉴定后，将细胞因子基因分别插入pT-U中，构建真核表达载体pT-GU、pT-IU。抽提质粒电穿孔法转染CHO细胞，免疫印迹法检测GM-CSF、IL4的表达，并通过细胞因子依赖细胞测活。
3.发酵工程菌DH5α(pT-U)，采用裂菌——QSepharoseXL粗纯化——Source30Q精细纯化的方法纯化质粒。经复合物凝聚法制备、比较不同浓度壳聚糖和质粒形成纳米粒子的形状、大小、稳定性，确定适合的浓度搭配。
4.发酵工程菌，纯化pT、pT-GU、pT-IU，并制备壳聚糖包裹的纳米粒子。将裸质粒pT-U和壳聚糖包裹的pT、pT-U、pT-GU、pT-IU分别滴鼻或口服免疫BALB/c小鼠，测定小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgA、粪便抽提物的sIgA，胃组织RT-PCR检测GAPDH、IFN-γ、IL10、mBD1、mBD3的表达水平。将壳聚糖包裹的pT、pT-U、pT-GU、pT-IU分别滴鼻或口服免疫沙鼠，末次免疫后2周灌喂109CFUHp动物适应株，4周后检测Hp定植情况。
结果：
1.构建了真核表达质粒pT-H和pT-U，电穿孔转染CHO细胞，证实能够表达目的蛋白HpaA和UreB。肌注免疫BALB/c小鼠后，血清特异性IgG水平表明，pT-U比pT-H能诱导更高的抗体水平，且差异非常显著(p＜0.01)。
2.构建了pT-GU和pT-IU，电穿孔转染CHO细胞，证实能够表达目的蛋白GM-CSF和IL4，且分别能够维持相应的细胞因子依赖细胞的生长。
3.通过发酵和纯化获得了高纯度的质粒pT-U。确定制备纳米微粒时，壳聚糖和质粒的较佳浓度分别为0.2％和200μg/mL。
4.裸质粒pT-U口服或滴鼻免疫不能诱导特异性免疫应答。经鼻免疫各组诱导的抗体均高于口服免疫组；当免疫途径相同时，血清抗体水平及粪便抽提物中sIgA水平为：Ch-pT-IU＞Ch-pT-GU＞Ch-pT-U；血清IgG亚类检测表明Ch-pT-GU、Ch-pT-U免疫后，IgG2a明显增高，Ch-pT-GU尤为明显，Ch-pT-IU免疫后，IgG1明显增高。胃组织的RT-PCR检测表明，β-免疫防御素的表达增高和载体有关，GM-CSF能促进其表达。各免疫组IFN-γ均有增高，其中Ch-pT-GU增加最为显著(p＜0.01)，Ch-pT-IU免疫组IL10表达明显增高，与其余组比较相差非常显著(p＜0.01)。
5.口服免疫组中，Ch-pT、Ch-pT-U、Ch-pT-GU、Ch-pT-IU免疫组的保护率为13.3％、20.0％、40.0％、60.0％。滴鼻免疫组中，Ch-pT、Ch-pT-U、Ch-pT-GU、Ch-pT-IU免疫组的保护率为14.3％、33.3％、57.1％、71.4％。
结论：
1.肌肉注射免疫时，pT-U比pT-H能诱导更高的特异性抗体，且相差非常显著(p＜0.01)；
2.通过发酵和碱裂解法破菌、阴离子交换柱纯化质粒的方法，能够大量获得满足实验要求的质粒；
3.采用复合物凝聚方法制备纳米核酸疫苗较佳浓度为：壳聚糖浓度为0.2％，质粒浓度为200μg/mL。
4.滴鼻免疫比口服免疫能够诱导更强的粘膜免疫应答。Ch-pT-U、Ch-pT-GU能诱导Th1型为主的免疫应答；Ch-pT-IU诱导以Th2型为主的免疫应答，分泌高水平的sIgA，可获得较高的保护率。