背景:尽管人类生活水平在不断提高,医疗技术的发展也非常迅猛:多种HCC诊断标志物被发现;免疫疗法、手术切除、放疗化疗等针对不同肝癌疗法在临床中也应用广泛。然而,世界范围内HCC的发病率仍在在不断上升,严重威胁着人类的生命健康。并且,很多类型的肝损伤最终都会发展成HCC,例如:病毒感染,脂肪肝,肝纤维化,肝硬化等等。表明,目前我们对于HCC的认识尚且存在缺陷,针对HCC的诊断及疗法不够全面;研究者需要重新审视HCC,挖掘其未知的问题。我们的课题是目前第一个提供HCC与TRPML1相关联的研究。对于TRPML1的功能或许有更深入的认识,为HCC发生的复杂机制可能提供一些新线索并且为HCC的临床治疗提供潜在的新靶点新方法。目的:探讨肝组织中是否存在TRPML1（ML-1）,TRPML1（ML-1）与肝损肝癌之间的关系,并在细胞水平上初步研究TRPML1（ML-1）影响肝损肝癌的机制。方法:首先,利用免疫组织化学染色法检测人肝癌组织芯片中是否存在ML-1,若存在,利用多光谱定量系统分析其规律;并进一步在昆明小鼠、C57 BL/6小鼠肝组织中验证。其次,采用Western Blotting法检测HepG2细胞中是否存在ML-1蛋白,HepG2细胞对ML-1激动剂ML-SA1的应答情况。在上述前提下,我们利用细胞内钙螯合剂、细胞外钙螯合剂、cAMP下游蛋白抑制剂等与ML-SA1单独或共同刺激HepG2细胞,检测ML-1、ERK_1/2、P-ERK_1/2蛋白的表达;探索TRPML1参与HCC的过程。结果:首先,我们检测到人肝癌组织中存在ML-1,且其总表达表现出一定的规律:ML-1在癌区表达较少;而在癌旁区和肝脂肪化的区域表达较多。将人肝癌组织芯片的120个样本定量后统计发现样本中总ML-1信号分布范围变化较大,但样本中总ML-1信号比较低。其中,10.83%的样本中没有检测到ML-1蛋白的信号,超过49%的样本中ML-1蛋白的信号为1-100。然后,我们在动物肝组织中验证肝组织ML-1的表达。发现昆明小鼠肝组织中存在ML-1;并且昆明小鼠肝癌组织中ML-1的总表达与人肝癌组织相比有相似规律:癌区几乎没有ML-1表达;癌旁区和脂肪化区域ML-1的表达相对较多。统计所有给药刺激5周、10周、15周及20周共4组昆明小鼠肝组织样本定量结果发现:5周组ML-1的总表达信号相比,10周组ML-1的总表达显著增加（P<0.001）;给药刺激15周（P<0.001）、20周（P<0.001）时ML-1的总表达显著减少。另外,15周组与20周组的ML-1表达总信号差异也具有统计学意义（P<0.01）。我们发现:在C57 BL/6小鼠肝中也存在ML-1;与对照组相比,模型组C57 BL/6小鼠肝损伤组织中ML-1的表达显著降低（P<0.001）。而且,昆明小鼠各组肝组织中ML-1表达平均值在中央静脉区域均显著多于门静脉区域（P<0.001或P<0.05）,5周组肝组织中ML-1的表达在脂肪化区域显著多于非脂肪化区域（P<0.001）;在C57 BL/6小鼠肝中也存在相似的规律。接下来,在细胞水平上初步探讨了ML-1影响肝损肝癌的机制。MTT法检测发现:ML-1激动剂ML-SA1作用HepG2细胞后,HepG2细胞的存活率保持在1.0左右（P>0.05,差异无统计学意义）。1、HepG2细胞中存在ML-1蛋白。ML-SA1浓度为6μM¹2μM时,随浓度增加,ML-1的表达显著增加（P<0.001）;而ERK_1/2磷酸化率则随ML-SA1浓度增加逐渐减少。浓度为12μM相比于为6μM时ERK_1/2磷酸化率也显著减少（P<0.01）。2、ML-SA1浓度为6μM及12μM时,随时间延长,ML-1的表达逐渐减少;在8 h（P<0.01）或/和4 h（P<0.001）时ML-1的表达显著低于对照组;而ERK_1/2磷酸化率则随ML-SA1刺激时间延长,表现出先增加后减少;刺激时间为1 h或/和2 h时达到最大值并显著高于对照组（P<0.001）。3、ML-SA1和PKA抑制剂Rp-cAMPs共同刺激HepG2细胞4 h。Rp-cAMPs刺激的最佳浓度为50μM。同无ML-SA1相比,两者共同刺激后ML-1的表达明显上调（P<0.001）;ERK_1/2磷酸化率也（P<0.05）显著上调。4、ML-SA1和Epac抑制剂ESI-09单独或共同刺激HepG2细胞4 h。与ML-SA1单独刺激相比,提前5 min加入ESI-09时ML-1的表达明显下调（P<0.05）。与两者同时加入及提前5 min加入ML-SA1相比,提前5 min加入ESI-09时,ERK_1/2磷酸化率显著上调（P<0.001）。5、ML-SA1和ESI-09单独或共同刺激HepG2细胞1 h。与两者同时加入及提前5 min加入ML-SA1相比,提前5 min加入ESI-09时ML-1的表达显著下调。与对照组相比,各给药组P-ERK_1/2表达均显著下调（P<0.001）。与提前5 min加入ML-SA1相比,提前5 min加入ESI-09时ERK_1/2磷酸化率显著下调（P<0.001）。6、1μM、10μM细胞内钙螯合剂BAPTA-am刺激HepG2细胞0.1 min、1 min、3 min、5 min。10μM BAPTA-am（P<0.001）刺激3 min、5 min相比1μM刺激（P<0.01）,ML-1的表达下调更显著。BAPTA-am刺激0.1 min时,ERK_1/2磷酸化率显著上调（P<0.001）,1 min有最大值（P<0.001）;5 min又迅速下调到对照组水平（P<0.001）。ML-SA1、细胞外钙螯合剂EGTA及细胞内钙螯合剂BAPTA-am单独或共同刺激HepG2细胞1 min、5 min、10 min、30 min。单独刺激5 min,BAPTA-am组ML-1显著上调（P<0.001）。单独刺激30 min,EGTA组（P<0.001）ML-1显著上调。单独刺激5min时,EGTA组ERK_1/2磷酸化率显著增加（P<0.001）。单独刺激30 min时,EGTA组ERK_1/2磷酸化率显著减少（P<0.001）。结论:1、首次在人肝癌组织及动物肝损肝癌组织中证明存在TRPML1（ML-1）,并且,ML-1的表达与肝损肝癌的发生发展相关联。2、ML-SA1刺激对HepG2细胞的增殖无显著影响。HepG2细胞中存在ML-1蛋白;6μM ML-SA1刺激时,HepG2细胞表现出应答,12μM时ML-1表达有最大值。而ERK_1/2磷酸化率与ML-1的表达是负相关的。后续实验中选择6、12μM ML-SA1刺激浓度对HepG2细胞进行刺激并检测蛋白表达。ML-SA1刺激时,随时间延长,ML-1的表达逐渐减少,表现出负相关。而ERK_1/2磷酸化率则随ML-SA1刺激时间延长先增加后减少并可达到最大值。后续实验中选择1 h和4 h两个ML-SA1刺激时间对HepG2细胞进行刺激并检测蛋白表达。3、Rp-cAMPs刺激的最佳浓度为50μM。Rp-cAMPs对ML-SA1刺激ML-1的表达和ERK_1/2磷酸化率的影响不明显。即是,ML-SA1刺激ML-1的表达和ERK_1/2磷酸化率不是经由cAMP-PKA途径实现。4、刺激4 h时,ESI-09影响ML-1的表达及ERK_1/2磷酸化率,并且该影响过程在其提前5 min加入时完成。即是,ML-SA1刺激ML-1的表达和ERK_1/2磷酸化率是经由cAMP-Epac途径实现。在HepG2细胞中,对于ML-1的表达ESI-09刺激与ML-SA1刺激有协同作用。刺激1 h时所检测的蛋白变化趋势几乎与刺激4 h时相反。似乎表明,ESI-09影响ML-SA1刺激HepG2细胞产生蛋白表达变化时,在HepG2细胞可能存在一个应答-反馈的回路。首先ESI-09影响ML-SA1刺激ML-1的表达,然后ML-1的表达影响ERK_1/2磷酸化率变化。5、细胞内钙螯合剂BAPTA-am短时间刺激HepG2细胞后能够引起ML-1的表达下调及ERK_1/2磷酸化率下降。对比发现,10μM BAPTA-am刺激下ML-1的表达下调更明显。因此,在后续实验中我们选择10μM作为BAPTA-am的实验浓度。EGTA对ML-1的表达及ERK_1/2磷酸化率的影响滞后于BAPTA-am,提示主要是细胞内Ca²⁺影响ML-1的表达及ERK_1/2磷酸化率。即ML-1的表达和P-ERK_1/2的表达变化主要是细胞内Ca²⁺外流引起的。结合上面的结果我们提出:ML-SA1刺激HepG2细胞影响ML-1的表达及ERK_1/2磷酸化率是一个动态变化的反馈过程:首先ML-SA1影响ML-1的表达,然后,表达变化的ML-1使得细胞内Ca²⁺外流,影响P-ERK_1/2表达,表达变化的P-ERK_1/2反过来又影响细胞内Ca²⁺外流进而影响ML-1的表达。即是在HepG2细胞内存在ML-1-Ca²⁺-P-ERK_1/2通路。综合考虑人们普遍认为的癌组织中P-ERK_1/2的表达上调和我们发现人及动物肝损肝癌组织中ML-1的表达下调,我们认为在肝癌肝损伤过程中也存在ML-1-Ca²⁺-P-ERK_1/2通路。