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叶黄素循环存在于所有的高等植物中,是植物在长期进化过程中所保存下来的一种代谢过程,其中依赖于叶黄素循环的热耗散是最主要的功能,玉米黄质环氧化酶基因编码的蛋白是该循环的两个关键酶之一。本研究利用RT-PCR技术克隆了西瓜玉米黄质环氧化酶基因ClZE,并对其进行了生物信息学分析。在此基础上,利用genome walking克隆了该基因的启动子。研究结果如下:1.通过RT-PCR获得ClZE基因的cDNA保守区片段,采用RACE技术获得了西瓜ClZE基因cDNA全长序列。ClZE基因全长2535 bp,包含1998 bp的开放阅读框,编码665个氨基酸残基的蛋白。预测蛋白的分子量大约为73.17KD,理论等电点为7.25,为中性氨基酸。基因登录号:HM107775。2.生物信息学分析,西瓜ClZE基因编码的蛋白为稳定性蛋白,没有信号肽,存在一个跨膜结构域,含有两个保守的结构域即Pyr_redox superfamily和FHA。3.西瓜ClZE编码的蛋白在NCBI网站上进行同源比对后,进行了进化树分析,发现ClZE保守序列与黄瓜聚为了一大类,其亲缘关系较近。4.构建ClZE基因的原核表达载体。pET-ClZE在28°C,通过终浓度为1 mM的IPTG诱导后,3 h时重组质粒出现特异条带。随诱导时间的延长,诱导特异蛋白表达量显著增加,9 h后蛋白表达量最高。SDS-PAGE图谱显示得到大约97 kDa的诱导表达重组蛋白。5.采用染色体步移技术克隆了ClZE基因的启动子,启动子的全长为1290bp。分析表明,ClZE启动子的翻译起始位点(ATG)上游,含有转录调控的保守元件TATA盒和CAAT盒。此外,还有响应低温和光的元件(LTRE1HVBLT49和-10PEHVPSBD)。表明该元件可能介导了ClZE对低温光的应答。6.利用DNA重组技术,构建了融合ClZE启动子的双元表达载体pCAMBIA3301-ClZE-Gus,以及用ClZE不同缺失片段长度报告基因Gus表达的双元表达载体,为进一步揭示ClZE基因的转录调控机制奠定了基础。