前言白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病,在恶性肿瘤死亡率中,白血病居第6位（男性）和第8位（女性）,在儿童和35岁以下成人中则居第1位,是一种严重威胁人民的生命健康的恶性疾病。目前,白血病的治疗采取以包括放、化疗、生物治疗、造血干细胞移植等多种现代治疗方式联合治疗为主要策略,已取得了很大的进展。但仍有不少患者疗效并非十分显著,出现耐药、复发等现象,影响了长期生存率,因此需要进一步探索新的治疗方法。光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）是近30年发展起来的一种新的治疗肿瘤方法,为光敏剂和病变细胞和组织选择性结合后,在特定波长、特定功率光源的照射下产生细胞毒性作用,从而起到杀灭病变细胞和组织的作用。PDT的三要素是光源、氧、光敏剂。近年来光动力疗法在治疗各种疾病特别是实体肿瘤中已取得令人瞩目的成就,但国内将光动力疗法应用于白血病方面的报道甚少,目前仍不清楚以5-氨基乙酰丙酸己酯（5-aminolevulinic acid hexyl esterhydrochloride,He-ALA）为光敏剂的光动力治疗（He-ALA-PDT）是否具有选择性杀伤白血病细胞的作用。目的本课题拟研究5-氨基乙酰丙酸己酯-光动力疗法（5-Aminolevulinic AcidHexylester Photodynamic therapy,He-ALA-PDT）对人红白血病细胞株K562及其多药耐药细胞株K562/ADM和人正常脐血单个核细胞（cord blood mononulcearcell,CBMC）的杀伤效应。探讨He-ALA-PDT是否具备有效杀伤多药耐药白血病细胞而不影响正常造血干细胞的功能;筛选出He-ALA-PDT杀伤白血病细胞的最佳光动力作用条件;并进一步探讨白血病细胞的死亡方式。为清除白血病细胞,及下一步将He-ALA-PDT应用于自体造血干细胞移植的移植物体外净化,降低移植复方率方面提供实验依据。方法第一章激光激发5-氨基乙酰丙酸己酯选择性杀伤人多药耐药白血病细胞株K562/ADM与亲本细胞株K562的光动力作用条件研究比较不同浓度的米托蒽醌、柔红霉素对K562、K562/ADM细胞杀伤效果的异同。细胞分4组:光动力（PDT）组（加光敏剂又接受光照）、激光组（不加光敏剂只接受光照）、暗毒性组（只加光敏剂而不接受光照）、正常对照组（不加光敏剂又不接受光照）。用不同浓度（0.025、0.1、0.4、1.6mmol/L）的He-ALA避光孵育细胞,然后给予630nm波长的不同功率密度（4.5、9、18、36 J/cm²）的激光照射后,继续培养12h,再测定细胞存活率。比较单一因素（激光或光敏剂）和联合因素（激光+光敏剂）对白血病细胞杀伤效果的异同;观察光动力作用各组细胞形态学改变;并筛选出最佳的光动力作用条件;在所筛选的条件下,探讨光动力作用对人正常脐血单个核细胞（Cord blood mononuclear cell,CBMC）的杀伤作用。第二章激光激发5-氨基乙酰丙酸己酯对人多药耐药白血病细胞株K562/ADM与亲本细胞株K562的体外杀伤研究细胞分为PDT组和正常对照组,以第一章筛选的光动力作用条件作用于K562、K562/ADM细胞。瑞氏染色观察光动力作用后白血病细胞形态学变化;流式细胞仪检测K562、K562/ADM细胞内光敏剂的荧光强度;采用甲基纤维素培养体系分析光动力作用对白血病细胞集落形成能力的影响;以MethoCult^TM GFH4434脐血集落复合培养基分析光动力作用对CBMC的红系爆式集落形成单位（BFU-E）、粒、单系集落形成单位（CFU-GM）及红、粒、单核、巨核系混合集落形成单位（CFU-MIX）形成能力的影响;采用Annexin V-FITC/PI双标法流式检测探讨光动力作用后继续培养2h、4h、8h后K562、K562/ADM细胞死亡方式的特点。统计学方法采用SPSS 11.5软件进行统计分析。定量数据以（?）±S表示。所用统计学方法主要包括析因分析,单因素方差分析和配对,检验分析。以P≤0.05表示差异有统计学意义。结果第一章激光激发5-氨基乙酰丙酸己酯选择性杀伤人多药耐药白血病细胞株K562/ADM与亲本细胞株K562的光动力作用条件研究1.米托蒽醌、柔红霉素对K562、K562/ADM细胞杀伤对比分析:米托蒽醌和柔红霉素对K562细胞的杀伤率显著性高于耐药株K562/ADM细胞（P＜0.001）。2.激光组和暗毒性组白血病细胞存活率:暗毒组细胞存活率均在96%以上,激光组细胞存活率均在89%以上。3.不同He-ALA浓度和激光功率密度对K562、K562/ADM细胞的杀伤效果:3.1光敏剂浓度对K562、K562/ADM细胞存活率的影响:在同一激光功率密度条件下,随着光敏剂浓度由0.025mmol/L逐渐增加至0.4mmol/L,K562、K562/ADM细胞存活率均随之降低,各组间两两比较具有显著性差异（P＜0.001）。在各种激光功率密度条件下,光敏剂浓度为0.4mmol/L和1.6mmol/L时,K562/ADM细胞的存活率均没有显著性差异（P=0.158）,K562细胞的存活率则进一步降低（P=0.001）。3.2激光功率密度对K562、K562/ADM细胞存活率的影响:同一光敏剂浓度条件下,随着激光功率密度由4.5J/cm²逐渐增加至18J/cm²,K562和K562/ADM细胞存活率均随之降低,各组间两两比较具有显著性差异（P＜0.001）。在各种光敏剂浓度条件下,激光功率密度为18J/cm²和36J/cm²时,K562细胞的存活率有显著性差异（P＜0.001）,而K562/ADM细胞的存活率却没有显著性差异（P=0.077）。3.3 K562、K562/ADM细胞的存活率对比:光敏剂浓度为0.4mmol/L时,激光功率密度由9.0J/cm²逐渐增加至36J/cm²,K562/ADM细胞的存活率高于K562细胞,两者相比具有显著性差异（P＜0.001）;激光功率密度为18J/cm²时,光敏剂浓度由0.1mmol/L增加至1.6mmol/L,K562/ADM细胞的存活率亦高于K562细胞,两者相比具有显著性差异（P＜0.001）。4.光动力作用对脐血单个核细胞的杀伤效果:正常对照组、0.4mmol/L暗毒性组、1.6mmol/L暗毒性组、18J/cm²激光组、36J/cm²激光组、0.4mmol/L+18J/cm² PDT组、0.4mmol/L+36J/cm² PDT组、1.6mmol/L+18J/cm² PDT组、1.6mmol/L+36J/cm² PDT组的细胞存活率分别为:100.00±2.12%、99.00±2.16%、96.12±3.56%、94.17±2.25%、91.13±1.18%、92.17±2.14%、83.53±2.64%、90.57±4.61%、81.76±3.78%。第二章激光激发5-氨基乙酰丙酸己酯对人多药耐药白血病细胞株K562/ADM与亲本细胞株K562的体外杀伤研究1.流式细胞仪检测白血病细胞内光敏剂的荧光强度:K562、K562/ADM细胞内光敏剂的荧光强度表达率分别为86.7%和59.8%。2.白血病细胞集落形成率测定:K562细胞正常对照组和PDT组集落形成率分别为:34.50±0.81%、1.03±0.06%;K562/ADM细胞正常对照组和PDT组集落形成率分别为:53.00±0.66%、12.20±0.95%。光动力作用对两种细胞均能造成显著性杀伤(P_K562＜0.001,P_K562/ADM＜0.001),但对K562细胞的杀伤情况比K562/ADM细胞更为显著（P=0.003）。3.脐血单个核细胞集落形成率测定:正常对照组和PDT组的BFU-E、CFU-GM、CFU-MIX集落形成率分别为35.33±2.08%和34.67±1.15%、29.00±4.36%和27.33±2.31%、47.00±2.00%和44.00±3.00%。和对照组相比,PDT组的BFU-E、CFU-GM,CFU-MIX三种集落的形成率没有显著性差异（P＞0.05）。4.光动力作用后K562、K562/ADM细胞死亡方式分析:对比两种细胞的总体生存情况,K562细胞的死亡率明显高于K562/ADM细胞。K562细胞以凋亡方式为主而坏死所占的成分不高;K562/ADM细胞的坏死和凋亡的比例则比较接近。两者均随光动力作用后的培育时间延长,细胞存活率均进一步降低,且细胞凋亡所占的比例随时间延长而降低,而坏死所占的比例随时间延长而增高。结论He-ALA-PDT可明显杀伤人白血病细胞株K562和多药耐药细胞K562/ADM,导致白血病细胞凋亡和坏死,降低白血病细胞集落形成率,同时对人正常CBMC的活性和自我复制与多向分化的功能影响很小,不会影响造血细胞的造血重建功能。两种白血病细胞对PDT存在不同程度的敏感性,其中K562细胞更为敏感。最佳的光动力作用条件为:0.4mmol/L的光敏剂浓度。18J/cm²的激光功率密度。实验证明He-ALA-PDT具有选择、高效杀伤白血病细胞的作用,为下一步将其应用于自体造血干细胞移植的移植物体外净化,降低移植复方率方面提供了实验依据。