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1研究目的与意义本研究的目的首先是对荔枝核进行成分提取与分离，在此基础上通过体外实验筛选出其最佳的抗肿瘤有效成分，并进一步探讨该有效成分对肿瘤细胞增殖抑制的机制；其次是明确荔枝核发挥抑制瘤细胞的成分结构，该成果将为荔枝核有效成分的药理药效深入研究提供基础。本研究的意义在于初步筛选出荔枝核具有抑制肿瘤细胞活性的粗提物，进一步验证了该成分的抑制瘤细胞途径为诱导细胞凋亡，并分析其可能的药效成分为黄酮类和四环二萜类化合物，该研究结果在荔枝核抗肿瘤有效成分的研发利用上具有实际应用价值。2研究方法2.1肿瘤细胞系的选择与特性研究本研究选择了肿瘤致死率较高的人肺癌A549细胞、肝癌Hep G2细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌SiHa细胞和Hela细胞进行生长特性研究，为药物抗肿瘤实验提供了前提条件。通过连续培养不同浓度的肿瘤细胞，采用MTT法检测并绘制细胞生长曲线，从中选取各细胞系的最适接种浓度和药物检测的最佳时间。此外，实验亦研究了DMSO（药物助溶剂）的毒性作用，以明确其安全使用的浓度。2.2荔枝核成分的提取与分离为探讨荔枝核不同成分体外抗肿瘤药效，首先要对其进行成分的提取和分离。本实验采用70%乙醇浸提结合超声助提的方式获取荔枝核总化合物成分，通过液液萃取结合大孔吸附树脂分离获得荔枝核石油醚相、乙酸乙酯相、D101树脂吸附相和水相成分，该四种粗提物将作为药物抗肿瘤实验的筛选成分。2.3荔枝核抗肿瘤有效成分筛选为明确荔枝核不同成分体外对瘤细胞增殖抑制的影响，实验采用MTT法检测不同浓度的荔枝核石油醚相、乙酸乙酯相、D101树脂吸附相和水相分别对A549、HepG2、MCF-7、SiHa和Hela细胞增殖影响，并筛选出四相成分共同的敏感细胞系，通过进一步比较各成分对其抑制作用的强弱，最终筛选出荔枝核抑制肿瘤细胞的最佳成分和对应的敏感瘤细胞系。2.4荔枝核乙酸乙酯相抑制MCF-7细胞机制研究通过体外抗肿瘤实验筛选，选出荔枝核乙酸乙酯相对MCF-7细胞的抑制作用最佳。为进一步探讨其作用机制，本实验首先采用Annexin V-FITC/PI双染法结合荧光显微镜观察细胞形态的方法，来探究药物是否有诱导细胞凋亡作用。然后通过罗丹明123染色法结合流式细胞术，检测药物对细胞线粒体膜电位的影响。此外，实验选用紫外和红外扫描的方式，对荔枝核乙酸乙酯相所含有的化合物成分类型进行初步分析。3研究结果3.1肿瘤细胞系的特性研究通过绘制细胞生长曲线，发现细胞接种浓度为3.5×104个/ml时，A549、Hep G2、MCF-7和SiHa细胞增殖活力最好；细胞接种浓度为0.5×104个/ml时，Hela细胞增殖活力最好。该5株细胞均在24h～48h增殖迅速，48h细胞活力最佳，此后进入平台期，因此可确定48h为药物实验的时间节点设计。此外，DMSO对瘤细胞毒性作用实验结果发现其浓度≤0.1%时，各细胞存活率与阴性对照无差异，而浓度≥0.2%时，Hep G2、MCF-7和SiHa细胞存活率便降低（p<0.05），因此，确定0.1%及以下为DMSO作用细胞的安全浓度。3.2荔枝核提取与分离本实验分离获得荔枝核四类不同极性成分：石油醚相为其非极性成分，乙酸乙酯相为弱极性成分，D101大孔树脂吸附相为极性成分和水相为强极性成分。干燥各成分至恒重，最终获得：石油醚相为6.0404g、乙酸乙酯相为13.5507g、D101大孔树脂吸附相15.5811g及水相成分8.0623g。3.3荔枝核肿瘤抑制有效成分筛选体外抑制肿瘤实验结果表明，荔枝核石油醚相、乙酸乙酯相、D101树脂吸附相和水相对MCF-7细胞的均呈现较好的生长抑制作用，p<0.01。比较各分离成分对MCF-7细胞的抑制作用，结果表明荔枝核乙酸乙酯相的抑制效果最佳，IC50为53.80mg/L。3.4荔枝核乙酸乙酯相抑制MCF-7细胞的机制初探通过Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡，发现100mg/L荔枝核乙酸乙酯相作用MCF-7细胞24h细胞核固缩断裂，作用48h凋亡小体形成。经罗丹明123染色法检测线粒体跨膜电位变化，结果表明经25～100mg/L荔枝核乙酸乙酯相作用24h，MCF-7细胞线粒体内罗丹明123荧光强度开始呈现不同程度下降，作用随药物剂量加大而增强(p<0.01)。进一步的红外和紫外扫描结果发现，荔枝核乙酸乙酯相表达出黄酮类和四环二萜类成分相关的特征吸收峰。4结论4.1通过五种瘤细胞系体外生长规律的探讨，掌握了最佳接种的细胞浓度，以及瘤细胞的生长持续时间，其中A549、Hep G2、MCF-7和SiHa细胞接种浓度均为3.5×104个/ml，而Hela细胞为0.5×104个/ml；最佳生长时间均为48h，该结果为后续荔枝核粗提物体外抑制瘤细胞作用的研究提供前提。4.2通过荔枝核分离物体外抑制肿瘤实验，发现不同瘤细胞系对中药成分的敏感性不同。荔枝核以其乙酸乙酯相抗肿瘤药效最佳，对应敏感瘤细胞系为MCF-7细胞，IC50为53.80mg/L。4.3荔枝核抗肿瘤细胞机制研究结果表明，其乙酸乙酯相可通过调控线粒体途径介导MCF-7瘤细胞程序性死亡的发生。经红外和紫外扫描和分析，初步判断该抗肿瘤有效成分含有黄酮类和四环二萜类成分。