【摘 要】
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根肿病作为一种在全球范围内广泛存在的十字花科专性寄生病害,严重影响了我国与世界油菜产业的安全,选育根肿病抗病品种是目前防控油菜根肿病最有效的手段。实验室前期利用常规感病品种华双5号（Brassica napus,AACC,2n=38）为受体亲本,以含有抗病位点PbBa8.1的欧洲芜菁ECD04（Brassica rapa,AA,2n=20）为供体亲本,通过杂交和多次回交,并结合分子标记辅助选择,在
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根肿病作为一种在全球范围内广泛存在的十字花科专性寄生病害,严重影响了我国与世界油菜产业的安全,选育根肿病抗病品种是目前防控油菜根肿病最有效的手段。实验室前期利用常规感病品种华双5号（Brassica napus,AACC,2n=38）为受体亲本,以含有抗病位点PbBa8.1的欧洲芜菁ECD04（Brassica rapa,AA,2n=20）为供体亲本,通过杂交和多次回交,并结合分子标记辅助选择,在BC3F4代选育出我国首批抗根肿病品种华双5R（HS5R）。经鉴定,该品种对四川、湖北、安徽等地的生理小种具有优异的显性免疫抗性。实验室前期已经将PbBa8.1位点初定位在A08染色体上的1.4 Mb大小范围内,在此区段内发现3个编码NBS-LRR结构蛋白的基因（BraA08t39211E、BraA08t39212E和BraA08t39305E）,然后通过同源序列法分离了其中的BraA08t39305E基因,与前人已克隆的CrrIa互为等位基因,并已通过发根农杆菌瞬时表达转化系统验证了其具有抗病功能并命名为PbBa8.1a（未发表）。本研究在此基础上,进一步缩小候选区段,拟通过精细定位旨在进一步确定PbBa8.1a是否为区间内的真正抗病基因。具体获得了如下研究结论:1.抗根肿病位点PbBa8.1的精细定位:利用实验室前期在对PbBa8.1初定位时所采用的BSA测序结果中的InDel结果信息,在区段内设计密集分子标记,并对所有标记进行了电子PCR检测和多态性分析,最终筛选出23对有良好多态性标记。随后利用这些标记结合它们在ECD04染色体上的物理位置,在BC3F4世代群体中进行了交换单株的筛选。从约7600个单株中筛选出34株相应重组交换单株,交换点分别位于A08染色体上14.1-15.3 Mb区间的不同位置。收获这34株重组单株的自交后代后,按株系分别进行室内接菌（枝江生理小种）,结合表型和基因型分析最终将抗病基因所在区段缩小到JF18和JF07标记之间约847 kb的区间内。2.通过遗传解析进一步证明PbBa8.1a具较弱抗性:在抗病芜菁ECD04重测序基因组（未发表）中,PbBa8.1a（BraA08t39305E）基因位于A08染色体上11.6-16.6Mb初定位区段内,但并不属于定位的847 kb区段内。但是,本研究发现当BraA08t39211E和BraA08t39212E所在的847kb候选区域为ECD04纯合基因型,PbBa8.1a（BraA 08t39305E）基因所在的15.4-16.6 Mb区域为杂合基因型,将该交换单株自交后代室内高浓度菌接种后,对应PbBa8.1a位点为纯合感病基因型的单株侧根基本都有微小瘤子发生。由此进一步从遗传上证明了 PbBa8.1a对根肿菌具微效抗性,而BraA08t39211E和BraA08t39212E所在的847kb为主要抗病区间,并将之命名为PbBa8.1b。3.候选区段内编码NBS-LRR结构的抗性候选基因分离与生物信息学分析:根据前人克隆的仅有的两个抗根肿病基因的编码蛋白均具有NBS-LRR结构域,因此本研究运用生物信息学技术对这847 kb主效抗病候选区段分析后发现,存在两个该类型基因:BraA08t39211E和BraA08t39212E。在此基础之上,将这两个候选基因克隆,并构建了一系列相关表达载体,为后续阐明基因的抗病功能奠定了重要基础。
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