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物种要延续下去，保存遗传信息并将其完整无误地传递给后代是十分重要的。这一过程依赖于完整可靠的DNA复制过程。DNA复制过程如果变得不稳定或者失去控制，无法保证各类遗传信息的正确传递和表达，就会造成生物体的各种缺陷及包括癌症在内的各类疾病甚至死亡。生物体已经拥有了一套强大完整的DNA复制体系来完成遗传物质的传递。但是复杂的体系也会有失灵的风险，为了应对这些风险，生物体配置了对应的DNA复制检验点机制以及修复机制。复制检验点维持真核细胞的基因组稳定性。在每一个周期的基因组复制过程中，细胞不可避免地受到内源性或外源性复制应激的挑战，包括异常的DNA结构、DNA损伤、蛋白质阻碍、癌基因诱导的异常复制、dNTP或组蛋白供应不足、复制转录冲突等等。复制检验点又称S期检验点，它帮助细胞应对上述挑战，确保在整个基因组复制前进行正确的复制叉进程。
除了复制基因组外，DNA复制叉还为许多在DNA复制检查点起作用的信号蛋白提供了一个组装平台。在酿酒酵母中，Mec1在DNA复制检验点通路中处于核心地位，它参与感知停滞的DNA复制叉，是哺乳动物细胞中ATR的同源蛋白。Ddc2(哺乳动物ATRIP同源蛋白)作为Mec1的调节亚单位，与Mec1形成蛋白质复合物。Mec1-Ddc2复合物通过复制蛋白A(RPA)包裹的单链DNA被招募到停滞的复制叉处。Hus1、Rad1和Rad9是复制检查点所需的另外三种蛋白质，它们形成的三聚体复合物与PCNA较为相似。这个三聚体在酿酒酵母中的同源物是Mec3-Radl-Ddc1。复制检查点的另一个必要因素是Rad17(酿酒酵母中为Rad24)，它类似于一个RFC亚单位，并且与RFCs2-5结合形成复合物。有人提出，与PCNA和RFCsl-5类似，Rad24-RFC复合体将Mec3-Rad17-Ddc1复合体加载到DNA损坏或复制受阻的位置。一旦被加载，Mec3-Rad17-Ddc1复合物会激活Mec1。
Mrc1(mediator of replication checkpoint)是DNA复制体的一个组成部分，在DNA合成过程中随复制叉沿着染色体移动。MRC1的缺失导致DNA复制缺陷，表明其在DNA复制的正常进展中的作用。同时，Mrc1也参与酿酒酵母和裂殖酵母细胞对羟基脲的反应。当DNA复制被羟基脲阻断时，Mrc1会经历Mec1和Rad3(Mec1的S.Pombe同源蛋白)依赖的磷酸化，Mrc1作为中介体，参与将复制应激信号从Mec1传递到Rad53效应激酶的过程。而在这个过程中，Rad24-RFC同样起着重要作用，可能参与调节Mrc1的磷酸化。有文献报道，磷酸化的Mrc1会将Mec1对Rad53的激活效率提高70倍左右。尽管人们对Mrc1在复制检查点中的作用进行过许多研究，然而，Mrc1的结构特征如何，与DNA有怎样的相互作用，与Rad24-RFC存在着怎样的相互作用且两者的相互作用受何种因素影响，这些问题都还没有任何信息。
为了解决这一问题，我首先尝试在酿酒酵母S.cerevisiae中内源纯化Mrc1，通过酵母同源重组的方法改造基因组，在目的基因后加入TAPm标签，再通过亲和层析的方法获得Mrc1。但由于体内与Mrc1相互作用的蛋白很多，且Mrc1的本底表达水平较低，这种本底表达后内源纯化的策略很不适用。幸运的是，我们获得了来自中国农业大学楼慧强实验室的馈赠——pGEX-4T-3-Mrc1重组表达质粒，可以在大肠杆菌重组表达系统中较好地表达全长的Mrc1。此外，我又在大肠杆菌中重组表达了酿酒酵母截短的Mrc1，获得了质量较好的Mrc1(287-1096AA)。我们利用体外孵育，得到了Mrc1(287-1096AA)与5flapDNA的复合物。通过电镜三维重构的方法，我们解析了Mrc1的第一个负染电镜结构，了解到Mrc1是一个接近环状的中介体蛋白，它可以将DNA“握住”，作为复制体的一部分，沿着DNA滑动。
另外，我们还重组表达了Mrc1(1-567AA)，将其与5flapDNA进行了体外孵育，通过电镜分析发现，截短后的Mrc1，无论是Mrc1(287-1096AA)还是Mrc1(1-567AA)，与DNA的亲和力都有明显提高，这可能是截短后Mrc1的DNA结合区域暴露出来的缘故。我们由此猜测，Mrc1的C端与N端之间存在一种别构调节，当C端与N端相互作用形成后，会别构抑制C端一侧的DBD与DNA的亲和力。
DNA的正确顺利复制是保证遗传信息稳定性的关键步骤，复制体如何结合DNA，产生复制压力后复制体如何响应并传递信号到下游通路，这是一个极其重要的课题。本文的工作以中介体蛋白Mrc1为切入点，通过电镜分析，阐述了Mrc1作为复制体的一部分，它整体趋于环状中心有孔洞的结构特征、且通过中心孔洞与DNA的结合及它与clamploaderRad24-RFC的相互作用，更加丰富地认识了Mrc1在DNA复制及复制压力应激反应中所发挥的作用，丰富了人们对复制叉行进及复制检验点的认识。
除了复制基因组外，DNA复制叉还为许多在DNA复制检查点起作用的信号蛋白提供了一个组装平台。在酿酒酵母中，Mec1在DNA复制检验点通路中处于核心地位，它参与感知停滞的DNA复制叉，是哺乳动物细胞中ATR的同源蛋白。Ddc2(哺乳动物ATRIP同源蛋白)作为Mec1的调节亚单位，与Mec1形成蛋白质复合物。Mec1-Ddc2复合物通过复制蛋白A(RPA)包裹的单链DNA被招募到停滞的复制叉处。Hus1、Rad1和Rad9是复制检查点所需的另外三种蛋白质，它们形成的三聚体复合物与PCNA较为相似。这个三聚体在酿酒酵母中的同源物是Mec3-Radl-Ddc1。复制检查点的另一个必要因素是Rad17(酿酒酵母中为Rad24)，它类似于一个RFC亚单位，并且与RFCs2-5结合形成复合物。有人提出，与PCNA和RFCsl-5类似，Rad24-RFC复合体将Mec3-Rad17-Ddc1复合体加载到DNA损坏或复制受阻的位置。一旦被加载，Mec3-Rad17-Ddc1复合物会激活Mec1。
Mrc1(mediator of replication checkpoint)是DNA复制体的一个组成部分，在DNA合成过程中随复制叉沿着染色体移动。MRC1的缺失导致DNA复制缺陷，表明其在DNA复制的正常进展中的作用。同时，Mrc1也参与酿酒酵母和裂殖酵母细胞对羟基脲的反应。当DNA复制被羟基脲阻断时，Mrc1会经历Mec1和Rad3(Mec1的S.Pombe同源蛋白)依赖的磷酸化，Mrc1作为中介体，参与将复制应激信号从Mec1传递到Rad53效应激酶的过程。而在这个过程中，Rad24-RFC同样起着重要作用，可能参与调节Mrc1的磷酸化。有文献报道，磷酸化的Mrc1会将Mec1对Rad53的激活效率提高70倍左右。尽管人们对Mrc1在复制检查点中的作用进行过许多研究，然而，Mrc1的结构特征如何，与DNA有怎样的相互作用，与Rad24-RFC存在着怎样的相互作用且两者的相互作用受何种因素影响，这些问题都还没有任何信息。
为了解决这一问题，我首先尝试在酿酒酵母S.cerevisiae中内源纯化Mrc1，通过酵母同源重组的方法改造基因组，在目的基因后加入TAPm标签，再通过亲和层析的方法获得Mrc1。但由于体内与Mrc1相互作用的蛋白很多，且Mrc1的本底表达水平较低，这种本底表达后内源纯化的策略很不适用。幸运的是，我们获得了来自中国农业大学楼慧强实验室的馈赠——pGEX-4T-3-Mrc1重组表达质粒，可以在大肠杆菌重组表达系统中较好地表达全长的Mrc1。此外，我又在大肠杆菌中重组表达了酿酒酵母截短的Mrc1，获得了质量较好的Mrc1(287-1096AA)。我们利用体外孵育，得到了Mrc1(287-1096AA)与5flapDNA的复合物。通过电镜三维重构的方法，我们解析了Mrc1的第一个负染电镜结构，了解到Mrc1是一个接近环状的中介体蛋白，它可以将DNA“握住”，作为复制体的一部分，沿着DNA滑动。
另外，我们还重组表达了Mrc1(1-567AA)，将其与5flapDNA进行了体外孵育，通过电镜分析发现，截短后的Mrc1，无论是Mrc1(287-1096AA)还是Mrc1(1-567AA)，与DNA的亲和力都有明显提高，这可能是截短后Mrc1的DNA结合区域暴露出来的缘故。我们由此猜测，Mrc1的C端与N端之间存在一种别构调节，当C端与N端相互作用形成后，会别构抑制C端一侧的DBD与DNA的亲和力。
DNA的正确顺利复制是保证遗传信息稳定性的关键步骤，复制体如何结合DNA，产生复制压力后复制体如何响应并传递信号到下游通路，这是一个极其重要的课题。本文的工作以中介体蛋白Mrc1为切入点，通过电镜分析，阐述了Mrc1作为复制体的一部分，它整体趋于环状中心有孔洞的结构特征、且通过中心孔洞与DNA的结合及它与clamploaderRad24-RFC的相互作用，更加丰富地认识了Mrc1在DNA复制及复制压力应激反应中所发挥的作用，丰富了人们对复制叉行进及复制检验点的认识。