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[背景]恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一,近年来,恶性肿瘤呈现发病率升高和发病早龄化的趋势。国内外的多种研究发现,机体里正常的细胞变成恶性细胞,需要机体内外包括癌基因在内的多种因素的作用,这个转变过程是分多个阶段逐步发生的复杂的长期过程。人们对癌基因在肿瘤发生发展中作用的研究已经有多年研究。结肠癌是西方国家常见的恶性肿瘤,也是我国城市地区多发的消化系统恶性肿瘤。近二十年,结肠癌的发病率和死亡率在全球范围内一直攀升。尤其在中国,结肠癌的发病率不低,而且死亡率也很高。然而结肠癌的病因和确切的分子机制还不完全清楚。SHP-2(Src homology 2-containing protein tyrosine cosphatase)是一种非受体型酪氨酸磷酸酶,会调节肿瘤的发生发展。最开始是在努南综合征(Noonan syndrome)和白血病中发现了 SHP-2的突变,后来有多个实验室陆续在多种实体瘤中也发现了 SHP-2的突变,发现SHP-2的突变在实体瘤中发挥了重要作用。SHP2-D61G的激活是SHP-2常见的激活突变之一,它会导致SHP-2中的结构域部分解离,暴露其PTP结构域的催化活性位点,从而导致SHP2酪氨酸磷酸酶活性的增强,进而参与下游多条信号途径的活化。上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transitions)简称 EMT,指在特定的病理生理情况下,具有极性的上皮细胞失去极性,向具有活动能力的间质细胞转变并获得侵袭和迁移能力,它的发生是多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。EMT是诱发肿瘤浸润和转移的早期关键事件,其与胃肠道肿瘤的侵袭转移有密切关系,有多种基因和分子均参与到EMT的发生过程中,其表型主要是上皮样蛋白marker E-cadherin(E-钙粘蛋白)的表达减少,和间质样蛋白marker表达的上调。结肠癌是上皮细胞肿瘤,在结肠癌的转移中也会出现EMT。但SHP2-D61G突变对结肠癌的增殖和迁移有是否有影响,在此过程中,是否有EMT的发生尚未有明确报道。综合上述背景,本实验设计了相关实验方案来探索SHP2-D61G突变对结肠癌的增殖和迁移的影响,以及在此过程中,是否有EMT的发生。[方法](1)用SHP-2+和SHP-2D61G质粒转染人结肠癌LOVO细胞,构建稳定的转染细胞模型。(2)用MTT,平板克隆形成实验,软琼脂集落形成实验检测LOVO细胞转染前后生长情况。(3)用粘附试验,划痕试验,Transwell实验检测LOVO细胞转染前后的迁移能力。(3)分析转染前后细胞的EMT相关蛋白的表达情况,分析其与EMT相关性。[结果](1)成功构建了 SHP-2+和SHP-2D61G转染的人结肠癌LOVO细胞模型。(2)SHP-2D61G突变对结肠癌LOVO细胞生长的影响:MTT实验结果显示,SHP-2D61G突变转染后,细胞增值率明显增加;平板克隆实验和软琼脂集落形成实验也表明细胞的克隆形成率多于对照组。以上结果说明SHP-2D61G突变促进了结肠癌细胞的克隆形成与增殖能力。(3)SHP-2D61G突变对结肠癌LOVO细胞转移的影响:细胞划痕实验结果显示,SHP-2D61G突变转染后,细胞的迁移速度明显高于对照组。粘附实验和Transwell实验结果发现,实验组细胞的粘附能力和迁移能力明显高于对照组,说明SHP-2D61G突变有增强结肠癌细胞体外迁移的能力。(4)SHP-2D61G突变导致了 EMT的发生:Western blot检测EMT相关蛋白marker,结果发现,SHP-2D61G突变组EMT上皮样marker是下调的,而间质样marker上调。[结论](1)成功构建了 SHP-2+和SHP-2D61G转染后的LOVO细胞模型;(2)SHP-2D61G促进了 LOVO细胞增殖和迁移能力;(3)EMT在SHP-2D61G对LOVO细胞生物学行为的影响过程中,发挥重要作用。