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类胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)是从动物血清中发现的一种能调控动物机体生长、发育和代谢的一个重要因子,不仅可以促进细胞对氨基酸和葡萄糖的摄取,增加蛋白、脂肪和糖原等的合成,还能刺激DNA复制、细胞增殖分化,刺激性腺分泌性激素,促进泌乳及新生动物小肠发育。猪血浆中IGF-1水平与体重及增重呈正相关,IGF-1基因可以作为影响动物生长发育的候选基因。目前尚无关于藏猪IGF-1表达的报道,本文首次对藏猪IGF-1成熟肽基因进行克隆,构建IGF-1成熟肽的原核表达载体pET-32a-IGF-1和真核表达载体pPIC9K-IGF-1,实现其在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中的表达,为进一步研究藏猪IGF-1成熟肽的生物学功能及在藏猪生长发育过程中的调节作用提供参考。1.IGF-1基因全长序列的扩增及生物信息学分析根据GenBank中猪IGF-1基因序列(登录号:DQ121132)设计引物,提取藏猪肝脏组织总RNA,应用RT-PCR技术从藏猪肝脏克隆出IGF-1基因,将藏猪IGF-1基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-IGF-1,经PCR鉴定、测序及分析得该基因大小为612 bp,包含一个完整的ORF,该ORF共有462个核苷酸,编码153个氨基酸,所测得的藏猪基因序列与Muller等报道的猪IGF-1基因编码序列高度同源,同源性为100%,与野猪、湖北猪的亲缘关系最近,遗传距离在0～0.003之间,与牛、羊、人、犬、鹿的同源性也比较高,均在90%以上,遗传距离在0.068～0.075之间,而与鼠和鸡的同源性较低,分别为87.2%和70.5%,表明IGF-1基因序列具有高度的保守性。2.IGF-1成熟肽cDNA的扩增及在大肠杆菌中的表达以pMD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽基因并构建成熟肽pET-32a-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western blot对其鉴定,并用CCK8法检测纯化后的IGF-1融合蛋白的生物活性。结果显示,获得藏猪IGF-1成熟肽基因序列(315bp)并成功构建原核表达载体pET-32a-IGF-1;重组大肠杆菌BL21-IGF-1主要以包涵体形式表达,分子量约31 KDa,最优IPTG浓度为0.5mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10h,最优IPTG温度是18℃;经SDS-PAGE和Western blot鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白,且纯化获得了高纯度的融合蛋白;CCK8法检测纯化后的IGF-1重组蛋白能够促进细胞增殖。结果表明成功构建了表达质粒pET32a-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白具有生物活性。3.IGF-1成熟肽序列的扩增及在毕赤酵母中的表达据GenBank中猪IGF-1基因设计一对引物,下游引物后端直接加上his尾巴和c-myc标签,以构建的藏猪pMD19-T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽基因序列,并将其克隆于表达载体pPIC9K,获得重组穿梭质粒pPIC9K-IGF-1,电转毕赤酵母GS115感受态,对重组酵母转化子经MM、MD平板筛选和PCR鉴定后,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达后进行Tricne-SDS-PAGE和Dot blot分析。结果表明,Tricne-SDS-PAGE和Dot blot分析显示IGF-1蛋白在毕赤酵母GS115获得成功表达,目的蛋白相对分子质量约为13 KDa;CCK8法检测纯化后的IGF-1重组蛋白能够促进猪淋巴细胞增殖。结果表明本研究成功构建了藏猪IGF-1成熟肽真核表达质粒pPIC9K-IGF-1,并在毕赤酵母GS115中得到了有效表达,表达产物具有促进细胞增殖的生物活性。