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目的化学物质低剂量效应的利弊是近年来争议的焦点,有研究认为低剂量对机体存在刺激作用,是有益的;但也有持反对意见者,认为不能忽视其产生的负面影响,尤其是低剂量的内分泌干扰物,因其特殊的生物活性而倍受关注。环境内分泌干扰物(EEDs)的研究多局限在高剂量所产生的毒效应上,对环境相关剂量(低剂量)的研究尚存在不足,目前为止,认为邻苯二甲酸酯类对机体的生物效应主要与其内分泌干扰活性有关。增塑剂DEHP作为明确的内分泌干扰物,具有多种毒性,低剂量DEHP是否会使疾病易感性增加,或存在一定的保护作用仍然不清楚。本课题选择DEHP及其代谢产物MEHP作为代表物质,观察低剂量条件下二者对细胞产生何种生物效应,并从细胞增殖信号通路和雌激素受体表达方面进行机制研究,为进一步探讨内分泌干扰物与其他疾病的关系提供更科学全面的线索。方法以雌激素受体表达阳性的人乳腺癌细胞系MCF-7作为研究对象,观察DEHP及MEHP在不同浓度和作用时间对细胞增殖的影响,并从雌激素受体表达、功能及PGE2信号通路方面探讨可能的作用机制。1.DEHP、MEHP对细胞增殖的影响。①CCK-8法及划痕实验检测低剂量DEHP、MEHP对MCF-7细胞生长的影响。②细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性检测DEHP及MEHP对细胞膜是否具有损伤作用。③流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.代谢产物MEHP对MCF-7细胞增殖影响的机制。①RT-PCR检测雌激素受体基因表达水平的变化。②拮抗雌激素受体前后MEHP对细胞增殖及功能的影响。③检测PGE2信号通路因子Akt、PKA、PI3K、CREB的mRNA表达。结果1.DEHP及MEHP会诱导MCF-7细胞增殖,其中E2及0.1μmol/LMEHP处理24h后,细胞增殖效应显著(P<0.05),100μmol/LDEHP处理48h后,细胞生长显著抑制(P<0.05);在划痕实验中,E2及0.1μmol/LDEHP、0.1μmol/L MEHP处理48h后,细胞也出现显著增殖(P<0.05)。2.0.1 μmol/L DEHP、0.1μmol/LMEHP 处理 24h 及 48h 后,细胞培养液中 LDH活性均低于DMSO对照组。3.100μmol/LDEHP 处理 24h 及 48h、100μmol/LMEHP 处理 48h 后,细胞总凋亡率均显著增高(P<0.05);而E2及0.1μmol/LMEHP处理24h后,细胞总凋亡率显著降低(P<0.05),其它剂量组无明显变化。4.1 μmol/L MEHP 处理 24h 及 48h 后,MCF-7 细胞 ERα 和 ERβ 的 mRNA 表达水平均显著降低(P<0.05)。5.拮抗雌激素受体后,因不同剂量、不同染毒时间MEHP引起的细胞增殖效应、LDH活性降低及细胞总凋亡率降低等显著性改变均消失。6.拮抗雌激素受体前后,MEHP引起的PGE2信号通路因子Akt、PKA、PI3K和CREB表达水平的变化情况无改变。即0.1μmol/L剂量组不同时间各因子表达水平仍分别显著低于对照组(P<0.05)。结论(1)较低剂量DEHP及MEHP会诱导MCF-7细胞出现增殖,降低凋亡率,减少对细胞膜的损伤。(2)MEHP与雌二醇具有相似的作用,雌激素受体封闭后,MEHP对MCF-7细胞产生的影响消失。(3)MEHP可经雌激素受体,触发下游PGE2信号通路,调节Akt/PI3K相关因子的表达,发挥生物学作用。