【摘 要】
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第一部分TCDD体外干预间充质细胞和上皮细胞的表型差异对比目的:通过100nmol/L、10nmol/L高低两种不同剂量的2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin,TCDD）体外分别干预组成腭突的间充质细胞（mouse embryonic palatal mesenchymal,MEPM）和上皮细胞（media edge epith
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第一部分TCDD体外干预间充质细胞和上皮细胞的表型差异对比目的:通过100nmol/L、10nmol/L高低两种不同剂量的2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin,TCDD）体外分别干预组成腭突的间充质细胞（mouse embryonic palatal mesenchymal,MEPM）和上皮细胞（media edge epithelia,MEE）,对比其增殖、凋亡、迁移的细胞生物学行为以及对上皮细胞间充质转化（Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT）过程的影响,探讨两种细胞在不同剂量的TCDD干预下细胞表型的差异及其在腭裂畸形发生中的作用。方法:将取自孕14.5天（Gestation Day 14.5,GD14.5）C57BL/6J胎鼠腭突原代培养的MEPM和MEE分别设对照组和实验组,实验各组分别用10nmol/L、100nmol/L两种不同浓度的TCDD培养基干预,与正常培养基孵育的对照组比较。CCK-8检测细胞24至96小时增殖变化;使用Transwell小室检测细胞24小时的迁移能力;流式细胞术检测细胞72小时凋亡差异;上皮细胞标志物Zo-1和间充质细胞标志物Vimentin免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜检测TCDD干预24小时和72小时后两种标志物荧光强度变化趋势。结果:1)成功原代培养腭突MEPM和MEE,上皮细胞Zo-1蛋白表达阳性;而间充质细胞Vimentin蛋白表达阳性;2)腭突MEE的增殖随着TCDD剂量增加呈下降趋势（P<0.01）;而TCDD低剂量促进MEPM增殖,高剂量抑制增殖（P<0.01）;3)腭突MEE的迁移能力不受TCDD的影响（P>0.05）;而TCDD低剂量促进MEPM迁移,高剂量抑制迁移（P<0.01）;4)TCDD对腭突MEE的凋亡能力无影响（P>0.05）,而随着TCDD剂量增加逐渐促进MEPM凋亡（P<0.01）;5)腭突MEE的EMT随着TCDD剂量逐渐抑制（P<0.01）。结论:腭突MEE的EMT是时间依赖性的自发程序。高剂量TCDD抑制MEPM的增殖、迁移,促进凋亡;低剂量TCDD抑制MEE的EMT,上述TCDD干预导致的MEPM和MEE功能障碍可能是TCDD致腭裂畸形的原因。第二部分间充质细胞外泌体干预间充质细胞和上皮细胞的表型差异对比目的:采用未处理及TCDD干预后间充质细胞所提取外泌体,分别处理腭突MEPM和MEE,观察两组外泌体分别对MEPM的增殖、迁移、凋亡的生物学行为以及MEE的EMT的影响。方法:将取自孕14.5天C57BL/6J胎鼠腭突的MEPM第三至七代作为提取外泌体的母本细胞,对照组用正常培养基,而实验组培养基为含10nmol/L的TCDD。每48小时收集细胞上清液并传代细胞,将收集的细胞上清液按照QIAGEN试剂盒提取外泌体的方法收集囊泡,通过透射电镜、蛋白质免疫印迹、粒径分析鉴定收集的囊泡为外泌体。通过PKH26荧光标记外泌体,按照100μg/ml的浓度与MEPM、MEE共孵育24小时,通过激光共聚焦显微镜观察MEPM和MEE吞噬摄取外泌体情况。MEPM和MEE各分为两个组,分别用正常间充质细胞产生的外泌体和TCDD干预后间充质细胞产生的外泌体按照100μg/ml的浓度进行处理。通过CCK8、Edu测增殖,划痕、Transwell实验测迁移,细胞流式术和蛋白免疫印迹测凋亡和免疫荧光激光共聚焦测EMT程度。将两组外泌体做测序筛查差异miRNA。结果:1)间充质细胞上清液收集的囊泡经鉴定为外泌体,并通过激光共聚焦显微镜证实间充质细胞分泌的外泌体可被MEPM和MEE吞噬摄取;2)较对照组相比,TCDD干预MEPM产生的外泌体抑制MEPM增殖、迁移,促进凋亡（P<0.01）;3)TCDD干预MEPM产生的外泌体较对照组抑制MEE的EMT过程（P<0.01）;4)TCDD干预MEPM后导致其分泌的外泌体携带的miRNA差异表达。结论:MEPM产生的外泌体可以同时被MEPM和MEE吞噬摄取。TCDD干预MEPM后产生的外泌体与TCDD直接干预MEPM和MEE产生的表型变化趋势一致。外泌体在TCDD诱导腭裂畸形发生中可能发挥着重要作用。
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