背景：肌动蛋白(Actin)是一种细胞骨架蛋白,它在细胞生理功能方面发挥了重要的作用,包括胞浆分裂、内吞、神经生长等。肌动蛋白发挥它的生物学功能主要是通过肌动蛋白重组(Actin remodeling),即单体肌动蛋白(G-actin)和丝状肌动蛋白(F-actin)之间的动态变化。肌动蛋白重组受多种蛋白的调控,例如ADF/cofilin、Arp2/3、 Eps8、Profilin、myosin Ⅱ、myosin Ⅴ。由于ADF/cofilin广泛分布于所有的真核细胞,并且对肌动蛋白重组具有最直接的调控功能,且对发育具有重要的作用,逐渐成为研究肿瘤转移、生殖系统疾病、循环系统疾病、神经系统疾病等的研究热点。神经细胞发挥正常的生理功能依赖于神经细胞正常的生长发育及分化。在神经元极性分化的过程中,轴突的生长早于树突,轴突末端的膨大称为生长锥(Growth cone),由丝状伪足(Filopodia)和板状伪足(Lamellipodia)构成,它们的动态变化指引了轴突生长的方向。在轴突生长锥的胞膜附近富含肌动蛋白网状结构,肌动蛋白动态变化是轴突生长的基础。神经营养因子尤其是目前研究最多的BDNF对神经元的生长、分化、存活及突触可塑性方面具有非常重要的作用。尽管如此,BDNF如何调控肌动蛋白重组促进神经元生长发育的具体机制有待进一步研究。在成年哺乳动物神经系统中,神经元绝大多数以化学性突触的形式互联,形成神经元网络。化学性突触大多是由突触前神经元的轴突末梢和突触后神经元的树突棘及两者之间的突触间隙组成。这种突触具有可塑性,表现为突触前膜释放神经递质具有可调控性,突触后膜的形态及受体数目具有可变性。肌动蛋白网络作为细胞骨架成分之一是维持突触形态结构基础,肌动蛋白细胞骨架的解聚和聚合与突触后膜AMPA受体内吞和上膜也有密切的联系。肌动蛋白的重组具有直接调节突触传递效率的作用,包括长时程增强(LTP)与长时程减弱(LTD),因此肌动蛋白的动态变化是突触可塑性及学习记忆的基础。虽然cofilin是调节肌动蛋白重组的关键分子,但是cofilin调控学习记忆的具体机制仍然不清楚目的：1.分析LIMK1/cofilin信号通路与BDNF及其受体TrkB的关系,并深入探讨LIMK1/cofilin信号通路参与调控BDNF诱导的轴突生长的分子机制,为进一步研究BDNF基因突变导致神经细胞生长发育异常疾病的干预措施提供理论依据。2.分析LIMK1/cofilin信号通路在学习记忆方面的作用,并深入研究条件性厌恶记忆消退过程IrL脑区中LIMK1/cofilin信号通路的作用及其机制,为今后研究以LIMK1/cofilin为靶点的临床相关疾病的治疗措施提供新思路。方法1. LIMK1/cofilin信号通路调控BDNF诱导的轴突生长的机制研究1.1LIMK1与TrkB之间相互作用的检测通过免疫共沉淀的方法分别检测外源性过表达LIMK1与TrkB的HEK293细胞裂解液和正常大鼠脑组织或神经元裂解液中LIMK1与TrkB能否相互结合。为了排除细胞裂解后使不同亚细胞器中的蛋白释放入裂解液中出现人为的结合,我们采用免疫荧光共定位的方法检测两种蛋白是否存在空间上的重叠性。从而证明TrkB与LIMK1在胞内发生相互作用的可能。1.2分析BDNF短时间刺激海马神经元对LIMK1蛋白的影响体外培养的海马神经元用BDNF刺激30分钟,通过蛋白免疫印迹的方法检测裂解液中LIMK1的磷酸化及二聚化情况,来反映LIMK1的活性变化。另外分离海马神经元的胞浆和胞膜成分,分别检测两种成分中LIMK1含量的变化,来反映LIMK1在胞内的分布情况。1.3TrkB与LIMK1发生相互作用的序列分析采用逐步缺失的方法,设计TrkB不同氨基酸序列突变体,分别和LIMK1进行外源性的免疫共沉淀实验,筛选出TrkB上与LIMK1相互结合的氨基酸序列,并将该序列嫁接到不能与LIMK1结合的T1蛋白上,再次进行外源性的免疫共沉淀实验,从而证明该氨基酸序列与LIMK1结合的必要性和充分性。1.4设计特异性抑制剂干扰TrkB与LIMK1的结合将筛选出来的TrkB中与LIMK1结合的氨基酸序列与具有穿膜作用短肽Tat进行融合,并对其进行生物素标记,以便于检测。用免疫荧光染色的方法检测该人工合成的融合肽是否能够进入胞内,用外源性和内源性免疫共沉淀的方法检测该抑制剂的干扰效率。并应用该抑制剂后再次检测BDNF刺激对LIMK1的生化特点的影响,来反映BDNF引起的LIMK1的各种变化是否依赖于TrkB与LIMK1的相互作用。1.5分析BDNF长时间刺激海马神经元对LIMK1蛋白的影响体外培养的海马神经元给予蛋白合成抑制剂后,再用BDNF刺激不同时间,最长达20h,检测LIMK1含量的变化,来反映BDNF刺激对LIMK1降解的影响。1.6分析药物干预TrkB与LIMK1相互作用对BDNF诱导的轴突生长的影响在神经元中过表达LIMK1或用小干扰RNA(siRNA)抑制LIMK1的表达,然后用免疫荧光染色的方法检测BDNF刺激对轴突生长的作用,来反映BDNF促进轴突生长的作用是否依赖于LIMK1。然后用人工合成的Tat融合肽干扰内源性TrkB与LIMK1的相互作用,检测BDNF对轴突生长的促进作用。此外,通过免疫荧光染色方法检测轴突生长锥(Growth cone)中LIMK1、cofilin的磷酸化及肌动蛋白actin的聚合情况,来反映LIMK1/cofilin信号通路调控轴突生长的下游机制。2. LIMK1/cofilin信号通路调控条件性厌恶记忆消退的机制研究2.1条件性味觉厌恶记忆模型的建立及各脑区中cofilin活性检测建立条件性味觉厌恶(CTA)行为学模型,分别在CTA记忆获得和消退过程的不同时间点取不同区域脑组织,采用蛋白免疫印迹的方法检测cofilin的磷酸化水平变化及cofilin的上游激酶LIMK1和磷酸酶SSH1的磷酸化变化情况,来反映cofilin活性变化的分子机制。2.2测试药物干预对行为学的影响在大鼠IrL脑区内埋管进行微量注射Tat融合肽抑制或增强cofilin活性及抑制GluA2上膜,观察对条件性味觉厌恶记忆及恐惧记忆消退的影响,来进一步证实cofilin活性对记忆消退的重要性及其机制。2.3检测突触体及其膜表面中谷氨酸受体的变化从脑组织中抽提突触体进行裂解检测各亚型AMPA受体及NMDA受体的含量变化,或将提取的突触体进行膜表面蛋白的生物素标记,用含有亲和素的琼脂糖珠子进行沉淀,获得膜表面蛋白的混合溶液,然后用蛋白免疫印迹的方法检测突触体膜表面各谷氨酸受体亚型的含量变化。2.4观察突触体形态结构的变化采用高尔基染色的方法观察CTA记忆消退过程中及药物干预cofilin活性后树突棘形态和密度的变化,来判断CTA记忆消退过程中突触形态结构的变化是否和突触传递效率的变化相同步。结果1. LIMK1/cofilin信号通路调控BDNF诱导的轴突生长的机制研究1.1LIMK1与TrkB之间存在相互作用在体外培养的HEK293细胞中过表达HA标记的LIMK1(HA-LIMK1)和Flag标记的TrkB (Flag-TrkB),进行免疫共沉淀实验。HA-LIMK1可以将Flag-TrkB沉淀下来,反之用Flag-TrkB也可以将HA-LIMK1免疫沉淀下来。此外,在体外培养的海马神经元中,用免疫荧光染色的方法发现红色荧光标记的LIMK1与绿色荧光标记的TrkB存在部分重叠。1.2BDNF短时间刺激体外培养的海马神经元可以引起LIMK1磷酸化、二聚化及胞内分布情况的变化在体外培养的海马神经元的培养液中加入BDNF刺激30分钟,收集细胞裂解液,通过蛋白免疫印迹的方法检测到p-LIMK1(?)曾加。在收集的蛋白裂解液中用不含p巯基乙醇和二巯基苏糖醇的上样缓冲液98℃加热,防止破坏二硫键,BDNF刺激后可以出现LIMK1的二聚化。此外,分别抽提胞浆成分和胞膜成分,BDNF刺激30分钟引起胞浆中的LIMK1降低,胞膜中LIMK1水平升高。1.3TrkB蛋白JM区域中的9个氨基酸介导与LIMK1蛋白的结合将TrkB蛋白的胞内域进行逐步缺失突变,发现缺失C末端(ACT)、缺失激酶区(ATK)后,TrkB仍能与LIMK1结合,但是进一步缺失近膜区即胞内域全部缺失(JM0)后,则不能与LIMK1结合。然后将JM区域细分成5个小片段,仍然采用逐步缺失突变的方法,发现JM5、JM4能和LIMK1结合,而JM3、JM2、JM1及JM0不能与LIMK1结合,因此JM4与JM3之间的差别序列(VIENPQYFG)为介导TrkB与LIMK1结合的关键序列。此外,我们将这9个氨基酸嫁接到T1蛋白上,发现原本不能与LIMK1结合的T1也可以与LIMK1结合。1.4干扰TrkB与LIMK1的结合抑制BDNF引起的LIMK1的磷酸化、二聚化及胞内分布的变化将筛选出的介导TrkB与LIMK1结合的氨基酸序列嫁接到穿膜肽Tat上(Tat-JMBox4),发现该融合肽能成功的进入神经细胞内,并能有效抑制TrkB与LIMK1的相互结合。用该人工合成的短肽封闭TrkB与LIMK1的相互作用后,发现BDNF引起的LIMK1的磷酸化、二聚化及胞内分布变化的现象被抑制。1.5BDNF长时间刺激可以延缓LIMK1的降解在体外培养的海马神经元的培养液中,加入BDNF分别刺激1、5、15、20h后收集裂解液,发现LIMK1的蛋白水平升高。如果在加入BDNF之前,提前加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide),发现加入BDNF组比不加BDNF组,LIMK1的半衰期延长,而用Tat-JMBox4干扰TrkB与LIMK1的相互作用后,BDNF对LIMK1的稳定作用被抑制。1.6BDNF诱导轴突生长依赖于TrkB与LIMK1的相互作用在体外培养的海马神经元中过表达LIMK1或者用小干扰RNA (siRNA)干扰LIMK1的表达,然后再用BDNF刺激,发现过表达LIMK1组神经元轴突快速生长,而干扰LIMK1表达后,BDNF促进轴突生长的作用被抑制。而且,用Tat-JMBox4抑制TrkB与LIMK1相互作用后,BDNF诱导轴突生长的功能被抑制。2. LIMK1/cofilin信号通路调控条件性厌恶记忆消退的机制研究2.1CTA记忆消退过程IrL脑区中cofilin活性增高消退测试第一天(E1-)不同时间点取脑组织进行检测,发现p-cofilin在测试后0.5h和2h明显升高。第三天消退测试(E3)后0.5h与第一天进行对比,发现p-cofilin明显降低,即cofilin活性增高。2.2CTA记忆消退过程中p-LIMK1和p-SSH1水平均降低消退第三天(E3)p-LIMK1和p-SSH1水平比消退第一天(E1)明显降低,即在CTA记忆消退过程中LIMK1活性降低而SSH1活性升高。2.3药物千预cofilin活性影响CTA记忆的消退进程在前三次记忆消退测试后,在IrL脑区立即注射Tat-Ser3增加cofilin活性可以加速CTA记忆消退,而注射Tat-pSer3降低cofilin活性则阻碍CTA记忆消退。然而,在前三次记忆消退后4h,在IrL脑区中给予这两种药物均对CTA记忆消退没有影响。2.4CTA记忆消退过程中突触体及其膜表面AMPA受体含量增加在CTA记忆消退过程中,IrL脑区的突触体及其膜表面GluA1和GluA2的含量显著升高,而GluA3、GluA4及NR-1则没有明显变化。但是,CTA记忆消退过程中,IrL脑区总的脑组织裂解液中GluAl和GluA2的含量没有变化。2.5药物干预cofilin活性影响突触后AMPA受体水平在CTA记忆消退的前三天,用Tat-Ser3增加cofilin活性,可以引起GluA1和GluA2在突触体膜表面的含量,而用Tat-pSer3抑制cofilin活性则显著降低了GluA1和GluA2在突触体膜表面的含量。2.6CTA记忆消退过程中突触形态结构没有明显变化在CTA记忆消退过程中,树突棘头颈比(head/neck ratio)及树突棘的密度均未发生明显的变化,即使用Tat短肽干扰cofilin的活性也对树突棘的形态及密度没有影响。2.7GluA2上膜抑制剂阻碍CTA记忆的消退在CTA记忆消退前三天给予GluA2上膜的抑制剂(Tat-pepR845A),或者在给予Tat-Ser3增加cofilin活性的同时给予GluA2上膜的抑制剂,发现CTA记忆消退进程减慢。结论1. BDNF引起LIMK1蛋白发生磷酸化、二聚化及胞内重新分布的现象依赖于TrkB与LIMK1的相互作用,LIMK1蛋白的二聚化使LIMK1蛋白稳定性增加,活性增强,通过磷酸化cofilin蛋白促进肌动蛋白的聚合,从而促进轴突的生长。2.记忆消退过程中激酶LIMK1蛋白和磷酸酶SSH1蛋白的协同作用,使得cofilin蛋白活性增强,虽然cofilin蛋白活性的增加没有引起树突棘的大小和密度发生变化,但是cofilin蛋白活性的增高促进了AMPA受体向突触体及膜表面转运,引起突触后传递效率增加,从而加速了记忆消退进程。创新点1. LIMK1/cofilin信号通路调控BDNF诱导的轴突生长的机制研究1.1研究发现了一种能与TrkB蛋白相互作用的新分子即LIMK1蛋白,并且找出了TrkB分子中与LIMK1相结合的具体的氨基酸序列。1.2发现BDNF刺激海马神经元对LIMK1存在两种不同的影响,即短时间作用可促进LIMK1活性增加并引起LIMK1在胞内重新分布,长时间刺激可稳定LIMK1蛋白延缓其降解。1.3研究发现BDNF诱导的轴突的生长依赖于TrkB蛋白与LIMK1蛋白的相互作用。2LIMK1/cofilin信号通路调控条件性厌恶记忆消退的机制研究2.1发现了cofilin调控记忆消退的具体分子机制。2.2研究发现突触传递效率的可塑性与突触形态结构的可塑性两者没有直接的相关性。