烟碱（Nicotine）是烟草特有的天然生物碱。随着对烟碱研究的深入,目前对烟碱的开发已经逐渐深入到化工、医药、食品保健等多个领域,具有广阔的应用前景。市场对烟碱的需求与日俱增,特别是高纯烟碱的需求更大。然而烟草叶片中的烟碱含量大约占叶片干重的0.6-3.0%。为了烟碱的开发利用,高烟碱品种必不可少。烟碱的生物合成离不开茉莉酸途径。在茉莉酸信号因子的作用下,烟碱转录因子被释放出来,与PMT（腐胺N-甲基转移酶）基因启动子上的G-box作用元件结合,进而调控烟碱的生物合成。不仅如此,PMT还是烟碱生物合成中的一个限速酶。本文我们通过克隆烟碱PMT1启动子,并对PMT1启动子上的G-box进行序列加倍,设计出1倍G-box,4倍G-box和10倍G-box的PMT启动子。通过将三种启动子替换掉pCAMBIA-NPT-GUS载体上的35S启动子,我们得到三种驱动GUS基 因 表 达 的 载 体:pCAMBIA-NPT-PMT1-1N-Pro-GUS（1N-GUS）、pCAMBIA-NPT-PMT1-4N-Pro-GUS（4N-GUS）、pCAMBIA-NPT-PMT1-10N-Pro-GUS（10N-GUS）。进一步,我们研究了上述三种 PMT1 启动子驱动PMT1基因的表达。我们的研究提供了一种新的提高烟碱表达的方法。研究的主要结果包括以下几个方面:首先,我们从Nicotina tabacum L.K326中克隆了 607 bp的PMT1启动子序列,并分析其响应元件。序列分析发现,扩增出来的PMT1启动子序列与N.sylvestris烟草PMT1启动子序列相似度较高。进一步利用在线数据库Plant-CARE启动子在线分析软件预测该序列含有启动子核心元件TATA-box、CAAT-box、G-box和GC-motif,并含有光、茉莉酸甲酯、赤霉素、热应答等响应元件。其次,为了研究G-box序列对PMT1启动子功能的影响。我们设计三种分别包含1个、4个和10个G-box元件PMT1启动子,并连接GUS基因,构建三种启动子载体:1N-GUS、4N-GUS和10N-GUS。通过农杆菌介导的方法侵染烟草,获得了转基因阳性植株,并对获得的启动子转基因株系进行了 DNA鉴定、GUS染色鉴定、GUS定量和GUS酶活检测。DNA鉴定结果表明三种载体成功整合到烟草基因组中。GUS染色结果发现三种启动子转基因植株叶片和根都可以被染成蓝色,并且根部的染色更深。对比三种启动子转基因植株染色情况,发现10N-GUS染色最深,其次是4N-GUS,1N-GUS染色最浅。GUS定量和GUS酶活结果与GUS染色结果一致,10N-GUS最强,其次是4N-GUS,然后是1N-GUS。GUS染色结果和GUS的表达检测表明G-box序列加倍提高了 PMT1启动子的活性。最后,为了研究G-box序列加倍对烟碱合成的影响。我们根据PMT1-mRNA（GenBank登录号:AB004322）序列设计引物,以烟草Nicotina tabacum L.K326的cDNA为模板,进行PCR扩增,获得了 1162 bp的PMT1基因序列。序列对比发现,克隆出来的PMT1基因序列与PMT1-mRNA序列相似度较高。将克隆到的PMT1基因序列替换已获得的三种启动子表达载体中的GUS基因,构建三种PMT1基因表达载体:1N-PMT1、4N-PMT1和10N-PMT1。通过农杆菌介导的方法侵染烟草,获得了转基因阳性植株。对转基因阳性植株的烟碱含量进行测定发现:三种转基因植株的烟碱含量都相对于对照有显著的提升,比对照至少高一倍以上,部分4N-PMT1和10N-PMT1株系的烟碱含量比对照高两倍以上,最高达到2.5倍。化学成分检测发现,转基因植株的总糖和还原糖相对于对照显著下降,钾含量则没明显变化。烟碱转录因子MYC2a和MYC2b以及PMT1基因的表达量相对于对照有显著提升,三种转基因烟草的PMT1基因的表达量没明显差异。