木霉TP-24固态发酵生产β-1,3-葡聚糖酶产酶条件及酶学性质的研究

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酵母β-1,3-葡聚糖是一种生物活性强、毒副作用低的高效生物应答物,但水溶性差而使其利用受到了很大限制。本文以实验室保藏的产β-葡聚糖酶菌株LE02为研究对象,采用固态发酵技术,对其产酶条件进行了优化,并利用层析、电泳等技术对β-葡聚糖酶进行纯化,就其酶学性质进行了研究,以便为酵母β-1,3-葡聚糖的酶法改性增溶奠定基础。主要研究结果如下: 1.在对保藏产酶菌株LE02进行纯化与复壮的基础上,经透明圈筛选和固态发酵试验,得到一株产β-葡聚糖酶高的菌株TP-24,其酶活达到355.37 U/g.ssc,比初始菌株酶活提高了32.38%。经形态观察,将菌株TP-24初步归属为木霉属(Trichoderma)。 2.研究了固态发酵产酶条件。碳源、氮源、水分含量、培养温度、培养时间、培养基初始pH、培养基通气条件及表面活性剂对菌株TP-24固态发酵产酶有一定的影响。以麸皮为基质,培养基中添加1.91%酵母粉和1.99%NH4NO3,料水比为1:0.79,于30℃发酵4d,β-葡聚糖酶活力达到594.37U/g.ssc,比对照产酶水平提高了273.55%。 3.对β-葡聚糖酶的分离、纯化与鉴定进行了研究。用pH5.0醋酸缓冲液抽提所得粗酶液经活性炭脱色、离心分离、(NH42SO4分段盐析、透析浓缩后,上SephadexG-100层析柱进行层析分离,获得了一个较高酶活的蛋白峰和一个无酶活的杂蛋白峰。浓缩含酶组分后,进行SDS-PAGE电泳分析,酶蛋白呈一条谱带,分子量近似为54.56 kD。该β-葡聚糖酶相对于粗酶液纯化了28.67倍,酶的比活力由11.96U/mg提高到342.95U/mg,酶的回收率为45.15%。 4.研究了β-葡聚糖酶酶学性质。β-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为55℃,该酶在pH3.0~5.0和30℃~40℃范围内稳定性高,在60℃~70℃酶活迅速下降。Zn2+、Ca2+、Fe2+对β-葡聚糖酶有一定的激活作用,Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cu2+对β-葡聚糖酶有一定的抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最强。该酶对β-1,3糖苷键有很高的专一性,能水解β-1,4糖苷键,但作用较弱,而对α-1,4糖苷键和含α-1,6糖苷键没有作用;当以CMC-Na为底物时,酶的米氏常数(Km)为3.85mg/ml,最大反应速度(Vmax)为20.88μg/min.ml,以酵母β-1,3-Glucan为底物时,酶的Km为8.02μg/ml,Vmax为5.59μg/min.ml。
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