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本研究拟通过添加GSK3特异性抑制剂BIO和CHIR99021,探讨Wnt/β-catenin信号通路在水牛类胚胎干细胞(水牛类ES细胞)增殖与分化过程中的作用及其调控的分子机制,进而优化水牛类ES细胞的培养体系。本研究分为以下四个试验。试验一探讨了GSK3抑制剂对水牛类ES细胞原始克隆形成的影响。在培养液中添加0.5μg/mLBIO或5mmol/LCHIR99021对水牛囊胚的内细胞团贴壁率无显著影响(91.18%和92.98%vs94.59%,P>0.05),但添加CHIR99021的原始克隆形成率(77.71%)显著高于对照组(55.41%,P<0.05),添加BIO的原始克隆形成率(72.06%)与对照组无显著差异(P>0.05)。试验二比较了GSK3抑制剂对水牛类ES细胞原始克隆增殖及传代效果的影响。通过水牛类ES细胞原始克隆增殖率的Brdu免疫荧光检测结果发现,CHIR99021组第1、3、4、5天显著高于对照组(P<0.05),而BIO组第1天显著高于对照组(P<0.05),其它天数差异不显著(O>0.05)。水牛类ES细胞原始克隆平均直径测量结果显示：CHIR99021组显著大于对照组(203.41μm vs128.01μm, P<0.05),BIO组(166.64μm)大于对照组,但差异不显著(P>0.05)。同时,与增殖相关基因PCNA表达的qRT-PCR检测结果发现,BIO和CHIR99021组的PCNA mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。此外,对BIO处理组、CHIR99021处理组、对照组的克隆分别进行传代培养发现：对照组和BIO组目前传至10代、10代,而CHIR99021组目前传至11代。试验三研究了GSK3抑制剂对水牛类ES细胞多能性标志基因表达的影响。Oct4、Sox2、Nanog mRNA相对表达量的qRT-PCR检测结果发现,CHIR99021组的Oct4、Sox2显著高于对照组(P<0.05),Nanog与对照组差异不显著(P>0.05); BIO组Oct4显著高于对照组(P<0.05), Sox2和Nanog显著低于对照组(P<0.05)。试验四探讨了GSK3抑制剂对水牛类ES细胞中Wnt信号通路的影响。免疫荧光技术检测Wnt信号通路的下游效应器β-Catenin蛋白的相对表达量发现,BIO和CHIR99021组显著高于对照组(P<0.05)。QRT-PCR检测Wnt信号通路的下游靶基因c-Myc mRNA的表达发现,BIO和CHIR99021组显著高于对照组(P<0.05)。上述研究结果表明,GSK3抑制剂(CHIR99021和BIO)对水牛类ES细胞增殖和多潜能性的维持具有促进作用,能提高水牛类ES细胞中P-Catenin和c-Myc的表达,且CHIR99021的效果优于BIO。说明Wnt/β-catenin信号通路对水牛类胚胎干细胞自我更新起着重要的作用。