乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV复制早期即开始合成一种中间体，由cccDNA反转录形成pgRNA及其他一系列RNA，开始病毒的复制增殖，cccDNA存在及数量标志着HBV的复制和复制的活跃程度。cccDNA的检测在HBV清除机制研究、抗HBV药物机制及药效学研究、对不同的乙型肝炎患者病情变化的监测均有重要的应用价值。但由于其结构上和生物学方面的特殊性，cccDNA特异性检测一直存在较大的难度。自二十世纪90年代初，不断有学者发明新的cccDNA特异性检测方法，但均未能推广。另外，目前有关cccDNA的研究数据大多通过鸭、土拨鼠、黑猩猩等实验动物模型和细胞模型中获得，而直接从慢性乙型肝炎患者等临床病人中获得的资料仍然比较缺乏。本课题从目前有关cccDNA特异性检测方法中筛选几种可能性比较大的方法进行验证，将能确切提高cccDNA检测特异性和灵敏度的方法进行优化，作为一种方法的几个步骤组合起来，并用此方法检测肝移植术后不同时期患者的外周血单个核白细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及慢性乙型肝炎患者的PBMC和肝组织穿刺标本。 本课题分为三个部分：一、HBVcccDNA特异性检测方法的筛选及优化；二、慢性乙型肝炎患者PBMC及肝组织中HBV cccDNA定量检测；三、肝移植患者外周血单个核细胞中HBV检测及临床意义。 一、HBV cccDNA特异性检测方法的筛选及优化 目的 对目前几种cccDNA特异性检测方法进行筛选，选择能更好地提高cccDNA检测特异性的几个方法组合起来，并将此组合的方法进行优化完善。方法 根据文献报道，选择理论上可以提高cccDNA检测特异性的几种方法：十二烷基硫酸钾(potassium dodecyl sulfate，PDS)-蛋白质沉淀核酸抽提法，嵌合引物(chimeric primer)cccDNA特异性检测法，特异性核酸酶切法，跨rcDNA缺口的PCR扩增法和实时荧光PCR法等，以慢性乙型肝炎患者血清、肝组织标本及HBV质粒标准品鉴定、选择最佳的几个方法，作为分步骤组合为一个新的方法，再对每个步骤进行优化，提高检测方法的特异性、灵敏度和稳定性。结果抽提HBV核酸后，先用不降解质粒的ATP依赖DNA酶(Plasmid-safe