中药栀子(Gardeniae Fructus)为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实，具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒，消肿止痛的功效。近年来越来越多的文献报导栀子及其主要活性成分京尼平苷(又称栀子苷)具有肝毒性，长期或大量使用可引起肝损伤。由于中草药多成分、多靶点的特性，其毒理机制研究较为困难，早期关于栀子肝毒性的研究主要停留于描述性研究层面，未能揭示栀子致肝损伤的内在机制。栀子在中医临床上较少单用而常与其他药材伍用，常与淡豆豉配伍组成栀子豉汤复方，且在此基础上加味可组成栀子大黄汤和茵陈蒿汤等多个栀子豉汤类方。淡豆豉(Semen Sojae Praeparatum)为豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr成熟果实的发酵加工品，具有解表，除烦，宣发预热等功效。研究表明，栀子豉汤与栀子相比肝毒性降低，其原因可能在于淡豆豉的配伍减毒作用，然而其作用机制尚不清楚。近年来，肠道菌群在肝脏疾病的发生发展中的作用日益凸显，且由于其对药物代谢和机体免疫应答等的作用，肠道菌群对药源性肝损伤(DILI)也有所影响。通过文献调研和前期实验我们发现，一方面，肠道菌群分泌的β-D-葡萄糖苷酶可将京尼平苷代谢为京尼平，后者是栀子产生肝毒性的直接物质基础；另一方面，淡豆豉可通过调控肠道菌群改善机体代谢。结合两方面的事实，我们推测淡豆豉可能通过调控肠道菌群降低栀子肝毒性。因此，本课题首先采用代谢组学的方法，分别从整体动物水平和细胞水平全面揭示栀子致肝损伤的机制；然后对基于肠道菌群的栀子豉汤配伍减毒机制进行深入探讨。具体研究内容如下：
　　1、为明确栀子的肝毒性，本课题首先使用高剂量的栀子提取物建立栀子急性肝损伤模型，并使用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q/TOF-MS)技术的代谢组学方法对血浆及肝脏样本分别进行分析。结果表明栀子给药剂量为9g/kg(折算为生药材，相当于京尼平苷300mg/kg)连续给药5天即可对大鼠造成明显的肝损伤，表现为体质量显著降低，肝指数显著增大，血浆生化指标显著上升以及肝脏组织切片明显异常。多元统计分析结果表明，栀子给药组大鼠血浆及肝脏样本均与空白对照组存在明显的分类趋势，结合单变量统计分析方法分别筛选出43个和25个与栀子致肝损伤相关的血浆和肝脏差异代谢物。对差异代谢物涉及的差异代谢通路进行分析，结果表明栀子给药组大鼠的血浆代谢异常主要表现在嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、初级胆汁酸生物合成、泛酸盐和辅酶A生物合成以及亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸降解异常；而肝脏主要涉及嘌呤代谢及半胱氨酸和蛋氨酸代谢异常。本部分工作对栀子致肝损伤的临床诊断提供了重要的物质基础，并为进一步阐明栀子致急性肝损伤的机制提供了一定的科学依据，对预防和治疗中草药源性肝损伤(HILI)具有借鉴意义。
　　2、为明确栀子致肝损伤的直接物质基础，本课题使用CCK8法比较京尼平苷和京尼平对HepG2细胞的毒性，并且对二者对细胞自噬的影响进行研究。结果表明京尼平对肝细胞的毒性明显大于京尼平苷，且其可能通过诱导肝细胞自噬引发肝细胞损伤。为探讨京尼平致肝细胞损伤与栀子致大鼠肝损伤的机制是否具有一致性，使用基于UHPLC-Q/TOF-MS技术的代谢组学方法对京尼平处理的HepG2细胞外液和内液进行分析。多元统计分析结果表明，京尼平给药组细胞外液及内液样本均与空白对照组细胞存在明显的分类趋势，结合单变量统计分析方法分别筛选出39个和24个与京尼平致肝细胞损伤相关的细胞外液和内液差异代谢物。对差异代谢物涉及的差异代谢通路进行分析，结果表明京尼平给药组细胞外液代谢异常主要表现在嘌呤代谢、色氨酸代谢、嘧啶代谢及精氨酸生物合成等代谢途径紊乱；而细胞内液主要涉及泛酸盐和辅酶A生物合成、维生素B6代谢及嘧啶代谢等代谢途径紊乱。此外，细胞外液中检测出大量胆汁酸相关代谢物，与给药组大鼠血浆中的情况相似。与整体动物中代谢组学结果相比较，在差异性代谢物方面，细胞外液与血浆中寻找到的差异代谢物重合度较高；在差异代谢通路方面，嘌呤代谢、嘧啶代谢、泛酸盐和辅酶A生物合成及氨基酸代谢是整体动物和细胞实验中找到的共同的差异代谢通路。本部分工作表明京尼平致肝细胞损伤与栀子致大鼠肝损伤的机制具有较高的一致性，使用京尼平替代栀子用于细胞层面的研究具有代表性。
　　3、为探讨栀子豉汤配伍降低栀子肝毒性的肠-肝轴机制，本课题使用抗生素建立伪无菌大鼠模型，并使用栀子及栀子豉汤分别对正常大鼠和伪无菌大鼠进行给药。采用大鼠体质量、肝脏组织切片和血浆生化指标作为肝损伤评价指标，结果表明栀子在伪无菌大鼠中造成的肝损伤小于正常大鼠，且同等剂量的栀子豉汤对正常大鼠造成的肝损伤小于栀子。采用16SrRNA高通量测序的方法对空白对照组、栀子给药组及栀子豉汤给药组大鼠肠道菌群的多样性和结构特征进行了全面分析。Alpha多样性结果表明栀子给药组大鼠盲肠内容物菌群多样性和丰度显著增大，栀子豉汤给药组与空白对照组相当；Beta多样性结果表明栀子组的微生物群落多样性与空白对照组有明显的差异，而栀子豉汤组与空白对照组菌群特征接近，说明栀子导致盲肠微生物群落结构变化，而栀子豉汤配伍可逆转这种变化。物种组成结果表明，栀子可使大鼠肠道菌群结构紊乱，使乳酸杆菌等有益菌丰度减少，肠球菌等条件致病菌丰度增大。栀子豉汤配伍可维持肠道菌群稳态，同时增大Akkermansia菌和普氏杆菌等益生菌的丰度，表明淡豆豉可能通过调节肠道菌群降低栀子肝毒性。此外，采用气相色谱质谱联用(GCMS)的方法对各组大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸(SCFAs)的含量进行测定。结果表明，栀子可显著降低肠道中丁酸的含量，而与淡豆豉配伍后丁酸含量恢复正常水平，说明淡豆豉通过增大丁酸产量对栀子导致的肝损伤有一定的抑制作用。本部分工作从肠道微生物系统的角度揭示了栀子豉汤配伍减毒的科学内涵，为今后以肠道菌群为靶点，降低中药肝毒性，预防和治疗HILI提供参考。
　　4、为验证丁酸在栀子豉汤配伍降低栀子肝毒性中的作用并探讨其作用机制，本课题以京尼平和丁酸为研究对象，分别在动物和细胞水平进行实验。在动物实验中，采用大鼠体质量、肝脏组织切片及血浆生化指标作为肝损伤评价指标，结果表明丁酸对京尼平所导致的肝损伤具有改善作用；采用免疫组化实验测定Nrf2蛋白表达水平，结果表明京尼平可显著上调肝脏中Nrf2蛋白的表达，丁酸可进一步促进其表达及核转移，从而增强机体对肝损伤的保护作用；采用血浆微生物脂多糖(LPS)水平和结肠组织切片评价肠道屏障的完整性，结果显示京尼平可增大大鼠肠道通透性，而丁酸可维持肠道屏障完整。在细胞实验中，采用CCK8法检测不同浓度的丁酸对京尼平肝细胞毒性的影响，结果表明在一定的浓度范围内，丁酸可增大京尼平处理的HepG2细胞的存活率；采用蛋白免疫印迹实验测定不同浓度、不同时间下京尼平和丁酸对Nrf2蛋白表达的影响，结果表明京尼平可上调Nrf2蛋白的表达，丁酸进一步促进Nrf2蛋白表达，并可延长其表达时间。本部分工作证明丁酸可通过促进肝脏Nrf2蛋白表达，延长其表达时间，维持肠道屏障完整性，从而降低京尼平的肝毒性。
　　综上，本研究采用代谢组学的方法，从动物和细胞水平分别揭示了栀子及其肝毒性直接物质基础京尼平的肝毒性机制，对栀子致肝损伤的临床诊断提供了重要的物质基础，并为进一步阐明栀子致肝损伤的机制提供了科学依据；从肠道菌群和肠道代谢物的角度探讨栀子豉汤配伍减毒的机制，并对丁酸在其中发挥的作用进行了验证，从肠道微生物系统的角度揭示了栀子豉汤配伍减毒的科学内涵，为今后以肠道菌群为靶点，降低中药肝毒性，预防和治疗HILI提供参考。