遗传多态性是在同一群体中出现的两种或者两种以上遗传决定的表型,由某一基因座上存在两个或者两个以上等位基因所引起,且等位基因的频率大于0.01。细胞色素P450(简称CYPs或者P450s)或尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(简称UGT)基因的遗传多态性既可导致内分泌调节因子体内平衡的改变,也可以引起其药物代谢能力的改变,从而产生血药浓度的个体差异。药物代谢酶的基因多态性在绝大多数情况下是单基因多态性,是由同一基因位点上的多个等位基因引起,在不同个体、种族、和地域间存在显著的差异。细胞色素P450同工酶是指在还原状态下与一氧化碳相结合,且在450nm处有特征性最大紫外吸收峰的单加氧酶超家族,主要分布于肝脏和肠道,参与P450s相关的I相和II相生物转化反应。主要作用机制为通过其结构中的血红素亚铁离子传递电子,氧化内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质,增强异源性物质的水溶性从而使其转化成更易排出体外的形式。细胞色素P450参与了90%以上药物的代谢,因此对人体药物代谢具有极其重要的作用。其中CYP4Z1是位于染色体1p33上CYP4中的一员,不同于其他细胞色素P450的是,CYP4Z1有着特殊的抑制剖面和产物区域选择性,这也与CYP4Z1缺乏共价连接的亚铁血红素的事实相吻合。近年来,因为CYP4Z1具有潜在的在相关癌症(乳腺癌、宫颈癌等)发展过程中的调节作用,引起科研界越来越多的关注。乳腺癌是世界范围内女性中最频发的癌症,由于乳腺并不是维持生命活动的重要器官,因此原位癌本身并不致命。但是在未及时发现并治疗的情况下,癌细胞可随血液和淋巴液向肺部、肝脏、骨甚至脑部发生转移,从而引发较高的死亡率。大量的基础和临床实验数据显示,CYP4Z1在乳腺癌细胞中过表达,CYP4Z1表达的增加能够促进人乳腺癌中肿瘤血管的生成生长,并且和乳腺癌的不同病理分级及不良预后高度相关,所以CYP4Z1编码基因的表达情况与乳腺癌发生发展有密切联系。一直以来,对CYP4Z1与乳腺癌的关系的推测为,CYP4Z1的过表达与乳腺癌细胞中20-羟-二十烷四烯酸(花生四烯酸在细胞色素P450代谢途径中的重要产物简称20-HETE)的生成量增加有关,由于CYP4Z1将花生四烯酸代谢为20-羟-二十烷四烯酸,而20-羟-二十烷四烯酸的过量产生是导致乳腺癌细胞在人乳腺癌中生长和扩散的原因。但最新研究表明,CYP4Z1作为潜在的找到乳腺癌治疗方法的突破口之一,是通过某种其他机制而不是由直接生成20-羟-二十烷四烯酸来调节乳腺癌的生长过程的,这也说明关于CYP4Z1在乳腺癌中的作用机制以及相互联系,有待进一步的研究确认。本课题将以调控人类CYP4Z1编码基因cyp4z1表达的启动子作为切入点,以发现对cyp4z1基因表达具有促进(或抑制)作用的转录因子为目的,发现更多用于治疗乳腺癌的前药的可能。启动子(promoter)是指一段在DNA链上能和RNA聚合酶识别、结合并且起始RNA合成的序列,本身不被转录,是基因表达过程中必不可少的调控序列。基于CYP4Z1在乳腺细胞中过表达以及CYP4Z1编码基因的启动子部分尚未得到研究的现状,我们作出如此假设:如果能够在人类CYP4Z1编码基因(cyp4z1)的启动子区域发现对转录过程具有促进作用的转录激活因子,那么这些促进cyp4z1基因表达的转录因子的抑制剂,将对发现治疗乳腺癌的前药产生巨大的推动作用。由此本课题主要分为两个部分。第一部分:整理和分析导致人类CYPs和UGTs中错义突变的常见的多态性变异。外显子组整合数据库(Ex AC)最近公布了从六万多个人类外显子组获得的等位基因频率数据,这大大超过了之前可用的外显子组变异数据库。从这些数据中我们提取了所有常见的可以导致CYPs(57个)和UGTs(22个)以及它们的辅助蛋白错义突变的单态核苷酸多态性突变型(single nucleotide polymorphism,简称SNP),从而分别获得了582个CYP、123个UGT以及32个包括CPR、Ad R和Adx的等位基因的发生频率的数据。通过分析一共来自83个基因的737个等位基因,我们作出了迄今为止公布的有关药物代谢酶中错义等位基因分布情况的最全面的概述。在所有突变型中,野生型始终被认为是最常见的等位基因,即使它与NCBI基因参考数据库(NCBI Reference Sequence Database,简称Ref Seq)中的1*等位基因和/或基因参考序列不同。根据我们的分析结果,在Ad R,CYP2A7,CYP2C19,CYP2D6,CYP4A22,CYP4F11,CYP4F12,CYP4V2,CYP8B1,CYP20A1,UGT1A3,UGT1A7,UGT2A3,UGT2B7和UGT2B15这15个基因中,我们发现最常见基因突变型的野生型蛋白质编码序列与基因参考序列并不相同。第二部分:人类cyp4z1基因的启动子分析。在真核生物中,启动子根据所对应的RNA聚合酶和相关蛋白质的不同分为三类,即分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行转录。其中Ⅱ类启动子即RNApolⅡ启动子涉及多种编码蛋白基因表达的控制,其基本结构特征是位于转录起始点上游,调节和控制转录起始。而在转录起始过程中,需要多种不同的蛋白分子协调帮助,即转录因子(Transcription factors,简称TFs)。转录因子是指一类能与基因5’端上游部分序列特异性结合,与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体,行使基因表达调控功能的蛋白质分子。转录因子的结合位点(transcription factor binding site,TFBS)是转录因子调控基因表达时,与模板链DNA结合的基因序列。我们首先通过世界上最大的转录因子数据库Genomatix Mat Inspector从有关基因转录和药物代谢等方面确定了14个我们感兴趣的转录因子及其结合位点:TGF-β诱导凋亡蛋白、细胞周期调节因子—细胞周期同源元件、人和鼠的ETS1因子、糖皮质激素的应答和相关元件、细胞和病毒myb样转录调节因子、GC-Box因子SP1/GC、固醇调节元件结合蛋白、核因子kappa B/c-rel、Brachyury基因、中胚层发育因子、E2F-myc激活子/细胞周期调节因子、多形性腺瘤基因、成肌细胞决定因子、c AMP反应元件结合蛋白、信号转导和转录激活因子。结合这些转录因子的结合位点以及人类CYP4Z1的启动子序列,我们从人类CYP4Z1编码基因启动子区域选定了有众多转录因子结合的1000bp的基因片段来研究人类CYP4Z1编码基因的启动子对基因的调控作用,用-1000/-1bp表示。通过缺失分析的方法将该1000bp的启动子序列联系目标转录因子结合位点缺失切割成若干片段,并且克隆到含有荧光素酶编码基因luc但本身不具备启动子基因的载体中,然后将重组载体瞬时转染到乳腺癌细胞MCF-7和乳腺上皮细胞MCF-10A中,MCF-10A细胞系作为对照进一步反映出乳腺癌细胞MCF-7内源蛋白和能够与CYP4Z1启动子序列结合并作用的转录因子的相互作用。由于载体中的荧光素酶的表达只能依赖于外源启动子控制起始过程,所以荧光素酶的表达情况间接反映了该段人类CYP4Z1启动子序列对基因转录的促进或抑制作用,从而能够分析出相关转录因子的结合位点。我们猜想在截取的1000bp启动子序列上会有多个对CYP4Z1编码基因的转录起促进作用的转录因子。首先,我们通过PCR以-1000/-1bp为模板扩增了四个片段:-1000/-1bp、-340/-1bp、-195/-1bp、-95/-1bp,构建四个重组载体,并将重组载体分别瞬时转染到MCF-7和MCF-10A两个细胞系中。转染48小时后使用与转染载体上的荧光素酶基因相对应的荧光素酶发光试剂盒检测转染后的细胞内荧光素酶的表达量。我们预测荧光素酶的表达会随着插入启动子序列的减短(理论上转录因子个数的减少)而降低。令人惊讶的是,对比相对发光值(荧光素酶表达情况的衡量参数)后我们发现,不管将重组载体转染到MCF-7还是MCF-10A中,随着外源启动子基因序列的减短,荧光素酶的表达情况整体呈现增强的趋势,也就是说在我们研究的1000bp启动子片段中,存在多个能够抑制而不是促进CYP4Z1表达的转录因子,我们称其为沉默子。其中在-195/-1bp与-95/-1bp之间存在最显著的差异,因而我们下一步将-1000/-1bp缺失切割为-800/-1bp、-623/-1bp、-400/-1bp、-220/-1bp、-170/-1bp、-145/-1bp、-120/-1bp这7个片段,同样将重组载体瞬时转染到MCF-7和MCF-10A两个细胞系中,来进一步缩小沉默子存在的区域从而最终确认它们的结合位点。根据实验结果,相对发光值在-195/-1bp和-170/-1bp之间有明显差异且后者小于前者,然而在-120/-1bp和-95/-1bp两组存在更加明显的差异,且-95/-1bp组明显低于-120/-1bp组,这就说明在-120～-95之间存在至少一个沉默子。最后我们使用同样的研究方法进行了-120/-1bp、-115/-1bp、-110/-1bp、-105/-1bp、-102/-1bp、-95/-1bp和-92/-1bp共7个片段的缺失切割及相关下游实验,来进一步缩小沉默子存在的区域从而最终确认它们的结合位点。根据最终实验结果,我们得知,不管是在MCF-10A还是在MCF-7中,-120/-1bp和-95/-1bp两组重组载体在细胞内引起的的荧光素酶表达量明显高于其他各组,且在MCF-10A中,-120/-1bp高于-95/-1bp组,但是在MCF-7中表达情况相反。这就说明在-120/-1bp和-115/-1bp之间存在与MCF-10A细胞环境特异相关的转录因子,而在-95/-1bp和-92/-1bp之间存在与MCF-7细胞内源蛋白相互作用的转录因子。根据实验结果,我们很难推断出和CYP4Z1表达相关的转录因子的具体结合位置。就我们目前所得到的数据来看,第一批重组载体中的荧光素酶基因在三次实验中都普遍存在较高的表达的能力,由于第二次和第三次缺失切割都是以第一批重组质粒为模板,不同批次的重组质粒会因为扩增次数、中间载体(生物公司合成目的序列所用的载体)、质粒提取方法等等因素产生对质粒中荧光素酶基因表达的影响作用,具体影响因素还有待进一步实验验证。假设我们的切割位点恰好避开了具有促进或者抑制cyp4z1基因转录起始作用的转录因子的结合位点,实验结果排除其他一切外在影响因素,我们可以得出多个起促进或抑制基因转录的转录因子的结合位点。根据我们最后确认的结合位点序列,我们可以通过生物素核酸标记的方法来进一步从细胞核蛋白中提取我们感兴趣的转录因子,并且通过蛋白质质谱来确认这些转录因子的相对分子量,化学式以及结构。总而言之,第二部分是通过切割分析的方法来研究人类CYP4Z1的启动子部分的转录因子对其表达的影响。经过研究结果分析,得到了多个潜在的对cyp4z1的表达起抑制作用的转录因子及其可能的结合位点。这将有利于针对这些转录因子的乳腺癌前药的发现,对我们从基因水平上寻找乳腺癌的治疗靶点产生推动作用。综上所述,导致人类CYPs和UGTs中错义突变的常见的多态性变异的归纳整理发现了15个CYPs和UGTs以及它们的辅助蛋白的最常发生的错义突变与已有的NCBI基因参考数据库记载的基因参考序列并不相同,这将对这些基因的药物代谢等方面的相关研究提供理论支持;人类CYP4Z1编码基因启动子的分析,发现了在启动子上有多个抑制该基因转录起始的沉默子,这打破了一直以来认为启动子上的转录因子大多具有促进转录作用的猜想,同时我们发现了多个沉默子的潜在的结合位点,这将对以后人类CYP4Z1启动子分析的相关深入研究奠定基础。