棉花(Gossypium hirsutum)是世界上最重要的经济作物之一,棉纤维作为一种天然纤维,是纺织工业的主要原料。棉纤维是由棉花胚珠表皮细胞极性伸长发育而来的一种单细胞结构的表皮毛,是研究植物细胞极性伸长和细胞次生壁合成的理想的生物材料。蓝铜蛋白(Blue Copper-binding Protein,BCP)是一类铜离子结合蛋白,广泛参与植物生长发育及逆境胁迫应答反应。在前期工作中我们从棉花中分离得到了一个纤维优势表达基因GhBCP4,对其在棉纤维发育中的功能进行了研究,结果如下:1、GhBCP4蛋白亚细胞定位分析蛋白结构预测显示,GhBCP4蛋白N端有信号肽(SP),C端有GPI锚定位点,铜离子结合结构域位于两者之间。为研究该蛋白的细胞亚定位,我们构建了多个GhBCP4与eGFP融合表达载体,进行棉花转化实验。结果显示,将eGFP报告蛋白放置于GhBCP4的C末端,在棉花阳性愈伤组织细胞中检测不到荧光信号;去掉GhBCP4蛋白的SP和GPI位点后,剩余的中间序列与eGFP融合表达,发现荧光信号主要集中于棉花细胞的液泡中;将eGFP序列插入到GhBCP4的铜离子结合结构域与GPI锚定位点之间,发现荧光信号主要集中于棉花细胞的细胞膜和细胞壁之间。以上结果表明GhBCP4蛋白定位于棉花细胞膜和细胞壁之间,其SP和GPI位点对该蛋白的准确定位具有重要作用。2、T3、T4代GhBCP4转基因棉花纤维表型分析对T3代GhBCP4转基因棉花材料,进行表达量和表型分析,并挑选出T3代RNAi转基因植株中GhBCP4的表达量低并且成熟纤维长度较野生型(WT)短的两个株系,过量表达的转基因棉花植株中GhBCP4表达量较高并且成熟纤维长度较野生型长的两个株系,将其种植下去对T4代转基因材料进行后续分析。测量转基因植株成熟棉纤维长度发现:过量表达GhBCP4的转基因棉花成熟纤维长度较野生型增加,而GhBCP4 RNAi转基因植株棉纤维长度则显著变短。3、RNA-seq分析GhBCP4转基因植株和野生型植株间差异表达基因为了进一步研究GhBCP4参与棉纤维发育的调控机制,对GhBCP4过量表达株系,RNAi株系与WT开花后12天的棉纤维进行转录组测序。RNA-Seq结果显示,在GhBCP4过量表达植株中共有1067个基因发生了差异表达,其中610个基因表达得到上调,而有457个基因表达出现下调。而RNAi植株中,共有1305个基因发生了差异表达,其中181个基因表达得到上调,而有1124个基因表达出现下调。GhBCP4-OE纤维细胞中,上调基因主要包括与乙烯、生长素、JA等激素的合成及信号传导相关基因,而下调基因主要为次生壁合成相关基因及参与次生壁发育调控的转录因子。这些基因在GhBCP4 RNAi样品中表达趋势刚好相反。以上结果表明GhBCP4过量表达能促进纤维细胞中乙烯、生长素的合成,激发乙烯、生长素应答基因的表达;同时过量表达GhBCP4下调一些棉纤维次生壁发生相关基因表达,这可能影响了纤维细胞次生壁的生物合成,而延长棉纤维伸长期的发育时间,从而提高了GhBCP4过量表达株系的棉纤维长度。相反,在GhBCP4RNAi棉纤维中,棉纤维次生壁合成和组装相关基因表达上调,可能促使棉纤维细胞提前进入次生壁发育期,棉纤维细胞伸长提前终止,最终导致RNAi株系成熟棉纤维变短。4、GhBCP4转基因棉花纤维素含量分析为进一步确定GhBCP4基因表达量的改变是否影响棉纤维次生壁纤维素含量,我们收取15、20和25天转基因棉纤维,通过固定纤维样品和石蜡切片分析,并提取转基因株系的细胞壁组分对其结晶纤维素含量进行分析。结果发现石蜡切片经纤维素特异性染料S4B染色后,GhBCP4过表达棉纤维中荧光与野生型棉纤维相比变弱,纤维素含量降低,但GhBCP4 RNAi棉纤维中荧光与野生型相比没有明显差异;然而,对于细胞壁组分中结晶纤维素含量的测定发现转基因材料与野生型相比结晶纤维素含量无明显变化,实验需进一步验证。5、GhBCP4互作蛋白的筛选鉴定GhBCP4蛋白与拟南芥ENODL14蛋白的序列相似度较高。已有研究表明,ENODL14与类受体激酶FER互作参与花粉管发育(Houet al.,2016)。于是我们选取了 5个与FER蛋白同源性较高且在棉纤维中表达量高的GhCrRLK1、GhCrRLK1 1、GhCrRLK14、GhCrRLK25、GhCrRLK27蛋白作进一步研究,利用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementary,BIFC技术,分析它们能否与GhBCP4互作。结果显示,GhCrRLK1和GhCrRLK25能与GhBCP4互作。该结果为阐明GhBCP4在棉纤维中的调控机制具有重要的价值,为后续的研究指明了方向。