刺激迷走神经在急性高眼压模型诱导的视网膜缺血再灌注损伤中神经保护作用及机制研究

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第一部分:程序性坏死在前房灌注急性高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤中的作用
  目的:探讨前房灌注急性高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤的模型的形态、电生理功能及下游分子机制。
  方法:将成年C57小鼠随机分为三组:对照组、视网膜缺血/再灌注(I/R)组和TAK-632+视网膜缺血再灌注(I/R+TAK-632)组。I/R组小鼠右眼持续前房灌注高压生理盐水1小时后恢复眼压1小时。选取再灌注后6小时,12小时、24小时及72小时和7天五个时间点取双眼视网膜。使用免疫荧光染色制作小鼠视网膜铺片,观察不同时间点视网膜各层结构细胞形态及数量的变化;测量C57小鼠暗适应条件下闪光全视网膜电图(f-ERG),观察各组视网膜功能变化情况;测量MLKL、p-MLKL、caspase-8和caspase-3等蛋白蛋研究视网膜缺血再灌注中程序性坏死的作用。同时使用RIPK1/3蛋白抑制剂:TAK-632,对小鼠进行玻璃体腔注射,来观察程序性坏死在早期(24小时)和晚期(7天)视网膜缺血再灌注模型中的作用。
  结果:与对照组相比,小鼠急性高眼压模型中,视网膜缺血再灌注损伤24小时和72小时时间点,RGCs数量出现明显差异(P<0.05;n=8);6小时与12小时的I/R组与对照组相比较,RGCs的数量无明显差异。在视网膜铺片,24小时及72小时时间点出现了RGCs的减少(P<0.05,n=8)。检测视网膜功能,我们以右眼急性高眼压处理,自身左眼为对照眼,分别进行暗适应下闪光全视网膜电图(ERG)检测。其中6小时左右两组全视网膜电图无差异;在12小时、24小时和72小时后可见,b波振幅相较于对照眼,开始出现下降(P<0.05,n=4),而a波则在24小时和72小时出现了振幅的下降。WB测量视网膜中凋亡及程序性坏死相关的蛋白,caspase-8的含量在视网膜I/R损伤后的72小时视网膜中开始出现;MLKL在视网膜中的含量则在24小时和72小时出现显著下降(P<0.05,n=4);而p-MLKL则在模型组中较对照组含量升高,升高的幅度在24小时达到顶峰,而后于72小时下降(P<0.05,n=8)。在视网膜缺血再灌注损伤后24小时视网膜中caspase-3的活性并无明显升高,而在7天后则出现明显的的c-caspase-3升高(P<0.05,n=8)。使用TAK-632抑制RIPK1/3后,TAK-632+I/R组中RGCs数量较I/R组上升,损伤7天后RGC细胞数量则较空白对照组明显下降(P<0.05,n=8)。
  结论:在前房灌注引起的视网膜缺血再灌注损伤模型中,视网膜神经节细胞出现减少,其数量下降随时间呈渐进性增长,最早出现在约24小时;而视网膜功能的下降较视网膜神经节细胞数量下降提前。该模型引起的视网膜神经节细胞的减少早期可能是通过程序性坏死引起的,并可通过抑制程序性坏死保护视网膜神经节细胞,但无法抑制晚期引起的视网膜神经节细胞的凋亡。
  第二部分:刺激迷走神经降低急性高眼压模型引起的视网膜功能损伤和缺血再灌注损伤
  目的:探讨在前房灌注急性高眼压模型中,刺激颈部迷走神经对视网膜神经节细胞的保护作用,并研究其对视网膜神经节细胞的缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。
  方法:先将成年SD大鼠分为两组,空白对照组(n=2)及迷走神经刺激(VNS)组(n=12),选取颈部迷走神经刺激时间点0小时、6小时及72小时作为三个时间点,通过标记元癌基因(c-fos)来找到激活的结神经节(NOG)-孤束核(NTS)-上泌涎核(SSN)-翼腭神经节(PPG)神经回路。再将SD大鼠随机分为缺血再灌注模型组(I/R组)和迷走神经刺激+缺血再灌注模型组(I/R+VNS组),每组设置右眼为实验眼,左眼为对照组。统计视网膜神经节细胞(RGC)数量;测量视网膜电位图(ERG);测量视网膜中肿瘤坏死因子α(TNF-α)及肠血管活性肽(VIP)水平。此外,测量翼腭神经节中血管紧张肽含量。
  结果:与对照组相比,刺激迷走神经后VNS组中结神经节、上泌涎核、孤束核以及翼腭神经节中元癌基因c-fos表达含量随着迷走神经刺激时间延长而增加。I/R组和I/R+VNS组对比,I/R组中ERG测定右眼视网膜功能显著下降,下降趋势因迷走神经刺激时间延长而更明显。此外,模型组中视网膜中TNF-α的变化较对照组明显升高。此外,当给与迷走神经刺激后,肠血管活性肽在视网膜和翼腭神经结中表达升高。
  结论:刺激颈部迷走神经可以保护视网膜,通过调控TNF-α降低视网膜缺血再灌注所受到的损伤,其机理为上调血管紧张肽的表达可激活NOG-NTS-SSN-PPG中枢核团系统,达到保护视网膜神经细胞的作用。
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